टेम स्टेम कोशिकाओं की छोटी संख्या के लिए एक वेस्टर्न सोख्ता प्रोटोकॉल
Summary
एक मानक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल ५०० टेम स्टेम या जनक कोशिकाओं के रूप में कुछ के रूप में विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया था । ऑप्टिमाइज़ेशन कक्ष नमूने के सावधान हैंडलिंग, ट्यूबों के बीच स्थानांतरण सीमित, और सीधे Laemmli नमूना बफ़र में कक्षों lysing शामिल हैं ।
Abstract
टेम स्टेम सेल (HSCs) दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं, माउस के साथ अस्थि मज्जा युक्त केवल ~ २५,००० phenotypic दीर्घकालिक HSCs । एक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल अनुकूलित और HSCs की छोटी संख्या (५००-१५,००० कोशिकाओं) के विश्लेषण के लिए उपयुक्त था । Phenotypic HSCs शुद्ध थे, सही गिना, और सीधे Laemmli नमूना बफर में लीजड ड । कोशिकाओं के बराबर संख्या युक्त Lysates सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) द्वारा विश्लेषण किया गया था, और दाग तैयार किया गया था और मानक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल के बाद संसाधित । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, २,०००-५,००० HSCs नियमित रूप से विश्लेषण किया जा सकता है, और कुछ मामलों में डेटा के रूप में कुछ के रूप में ५०० कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है, २०,००० से ४०,००० कोशिकाओं को सबसे प्रकाशनों में रिपोर्ट की तुलना में । इस प्रोटोकॉल आम तौर पर अंय टेम कोशिकाओं के लिए लागू किया जाना चाहिए, और मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का उपयोग कर कोशिकाओं की छोटी संख्या के नियमित विश्लेषण में सक्षम बनाता है ।
Introduction
टेम स्टेम सेल (HSCs) स्व-नवीकरण कोशिकाओं है कि सभी रक्त वंश को जंम दे सकते हैं । वे अस्थि मज्जा में अपेक्षाकृत दुर्लभ कोशिकाओं रहे हैं, जैव रासायनिक विश्लेषण मुश्किल प्रतिपादन । इस तरह के प्रवाह cytometry के रूप में दुर्लभ कोशिकाओं, विश्लेषण के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण, सेल सतह मार्करों और intracellular प्रोटीन के सापेक्ष मात्रा को बढ़ाता है के लिए अत्यंत उपयोगी है । हालांकि, intracellular प्रोटीन के विश्लेषण एंटीबॉडी पहुंच सक्षम करने के लिए सेल permeabilization प्रक्रियाओं का उपयोग आवश्यक, और नहीं सभी सेल सतह epitopes बच इन प्रक्रियाओं1,2। इसके अलावा, एंटीबॉडी कि विभिंन प्रोटीन isoforms या दरार उत्पादों के बीच भेदभाव अक्सर प्रवाह cytometry के लिए उपलब्ध नहीं हैं, और इसलिए जांचकर्ताओं अभी भी विश्लेषण के कुछ प्रकार के लिए पश्चिमी दाग पर भरोसा करते हैं ।
सेल lysates के पश्चिमी दाग विश्लेषण अधिकांश प्रयोगशालाओं में एक नियमित प्रक्रिया है । कोशिकाओं को देशी शर्तों के तहत शुद्ध किया जा सकता है कि कोशिका सतह अणुओं के epitopes की रक्षा, और सेल lysates बाद में तैयार किया जा सकता है और विश्लेषण । हालांकि, पश्चिमी दाग द्वारा दुर्लभ प्राथमिक कोशिका आबादी में प्रोटीन के विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पशुओं के euthanizing बड़ी संख्या की आवश्यकता हो सकती है । कई कदमों के लिए छोटे समायोजन करने से, एक पारंपरिक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल HSCs की अपेक्षाकृत छोटी संख्या में प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम था (५००-१५,०००, ब्याज के प्रोटीन पर निर्भर करता है) । समायोजन सही कोशिकाओं की गिनती शामिल हैं, ध्यान से हैंडलिंग सेल गोली, ट्यूबों के बीच कोशिकाओं के स्थानान्तरण को कम करने के लिए सेल नुकसान को कम करने, और lysing एक केंद्रित लोडिंग बफर के साथ कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या proteasome युक्त और फॉस्फेट अवरोधकों । कई प्रकाशित रिपोर्टों पश्चिमी २०,००० या अधिक HSCs3,4,5,6,7के साथ प्राप्त दाग शामिल हैं; यह सरल प्रक्रिया के बीच 4 और ४० गुना द्वारा समकक्ष डेटा का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं और प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या कम हो जाएगा । प्रोटोकॉल के बजाय एक आंतरिक नियंत्रण करने के लिए, प्रति कक्ष आधार पर परिणामों को सामान्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस प्रोटीन के स्तर में समग्र कटौती का पता लगाने में सक्षम बनाता है कि अगर डेटा एक आंतरिक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है अनदेखी कर सकते हैं । प्रति कोशिका आधार पर सामान्य करने का महत्व जीन अभिव्यक्ति डेटा8के विश्लेषण के लिए वर्णित किया गया था, और एक ही सिद्धांत पश्चिमी दाग द्वारा बढ़ाता प्रोटीन पर लागू होता है । इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए कोशिकाओं की छोटी संख्या का विश्लेषण करने की जरूरत किसी के लिए उपयोगी होना चाहिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पश्चिमी सोख्ता विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने और ऊतकों या कोशिकाओं में संकेत रास्ते के सक्रियण के लिए एक आम तकनीक है । एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया प्रक्रिया के लिए छोटे समायोजन शुरू करके, हम नियमित रू?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01 CA149976 (एन. ए. एस.) ने इस कार्य का समर्थन किया.
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
Referências
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- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
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