西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない
Summary
しみが付くプロトコル標準ウエスタンとして 500 造血幹前駆細胞の数を分析するため最適化を行った。最適化を含むセルのサンプルの処理、管の転送を制限して塩化物イオンとサンプル バッファー内セルを直接溶解に注意してください。
Abstract
造血幹細胞 (造血) 希少な細胞は、長い間 25,000 〜 表現型を含むマウス骨髄再 HSCs を長期的です。西部のしみが付くプロトコルの最適化され、造血 (500-15,000 細胞) の小さな数字の解析に適した。表現型の HSCs 精製、正確にカウント、塩化物イオンとサンプル バッファーに直接分離します。同じ数の細胞の溶解液はナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析されたとしみが準備され、次の標準的な西部のしみが付くプロトコルを処理します。このプロトコルは、2,000-5,000 を使用して HSCs を定期的に分析して 500 セル、ほとんどの出版物で報告される 20,000 に 40,000 セルと比較して少ないからいくつかのケースでデータを取得できます。このプロトコルは、その他の造血細胞に一般に適用されるべきし、少数の標準的な検査手順を使用してセルのルーチン分析が可能します。
Introduction
造血幹細胞 (造血) は、すべての血液系統に上昇を与えることができる自己更新のセルです。比較的希少な細胞の骨髄、生化学的解析を困難にレンダリングしています。アプローチ フローサイトメトリーなどの希少な細胞の解析に適しては、セル表面のマーカー、細胞内タンパク質の相対的な量を定量化するために非常に有用されています。細胞内タンパク質の解析抗体アクセスを有効にするセル透過手順の使用を必要とし、すべてではない細胞表面抗原生き残るこれら手順1,2。さらに、異なるタンパク質アイソ フォームや胸の谷間の製品を区別する抗体が多い、フローサイトメトリー用利用可能なしたがって調査官まだに依存西部のしみ特定のタイプの解析。
セル lysates の西部のしみの分析は、ほとんどの実験室の定期的なプロシージャです。細胞表面抗原のエピトープを保持するネイティブの条件下で細胞を浄化することが、セル lysates の準備および分析できる後。ただし、まれな一次電池しみの西部で人口におけるタンパク質の解析は十分なセルを取得する動物の数が多いを安楽死させる要求できます。いくつかの手順を微調整すること、によって、従来の西部のしみが付くプロトコル HSCs (500-15,000、興味の蛋白質によって) の比較的少数の蛋白質を検出することができた。調整は、セル、セルのセル損失を最小限に抑えるためのチューブ間の移管を軽減、細胞ペレットを慎重に処理を正確にカウントし、バッファー含むプロテアソームの集中載荷時とセルの定義された数を溶解し、ホスファターゼ阻害剤。パブリッシュされたレポートの多くは、20,000 以上 HSCs3,4,5,6,7で得られた西部のしみこの簡単な手順は、セルと 4 と 40 倍の間で相当のデータを生成するために必要な実験動物の数を減らすは。プロトコルは、内部統制ではなく、セルごとに結果を正規化する設計されています。これは、内部のコントロールにデータが正規化された場合に見落とすことができる蛋白質のレベルの全体的な削減の検出を可能。 にします。セルごとに正規化の重要性は、遺伝子発現データ8の分析について説明された、西部のしみによって蛋白質を定量化する同じ原則が適用されます。この最適化されたプロトコルは、細胞の小さな数字を分析する必要がある誰にとっても便利でする必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
西部にしみが付くことは、組織や細胞の特定の蛋白質とシグナル伝達経路の活性化を検出するための一般的な手法です。一般的に使用されるプロシージャを微調整を導入し、15,000 HSCs と 500 HSCs として、いくつかのいくつかのケースで日常的に 15 の異なった蛋白質 (資材表) を検出することができました。The most このプロトコルの重要なステップは、: 1) 正確にセルをカウント、2) …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
健康の国民の協会付与 R01 CA149976 (N.A.S) はこの仕事を支えた。
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
Referências
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