Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma
Summary
Standart bir Western blot Protokolü 500 hematopoetik kök veya progenitör hücre olarak birkaç analiz etmek için optimize edildi. En iyi duruma getirme dikkatli hücre örneği işleme, tüpleri arasında aktarımlarını sınırlama ve doğrudan Laemmli örnek arabellek hücrelerde lysing içerir.
Abstract
Hematopoetik kök hücre (HSCs) nadir hücreleri, fare kemik iliği sadece 25.000 ~ fenotipik içeren uzun süreli kullanıma HSCs. Batı blotting iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş ve HSCs (500-15000 hücreleri) az sayıda analizi için uygun. Fenotipik HSCs saf, doğru sayılır ve Laemmli örnek arabellekte doğrudan lysed. Hücreler eşit sayıda içeren Lysates Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından analiz edildi ve leke hazırlanmıştır ve standart Western blot protokolleri takip işlenir. Bu iletişim kuralı, 2000-5000 kullanarak HSCs düzenli olarak analiz edilebilir ve bazı durumlarda veri olabildiğince az 500 hücreler, çoğu yayınlarda bildirdi 20,000-40,000 hücrelere kıyasla olarak elde edilebilir. Bu iletişim kuralı diğer hematopoetik hücrelerin genel olarak uygulanabilir olmalıdır ve az sayıda hücre standart Laboratuvar yordamları kullanarak rutin çözümleme sağlar.
Introduction
Hematopoetik kök hücre (HSCs) tüm kan soy çıkmasına neden olabilir kendini yenileyerek hücrelerdir. Onlar nispeten nadir biyokimyasal analizler zor işleme kemik iliği hücrelerinde vardır. Akış Sitometresi gibi nadir hücrelerin analiz etmek için uygun yaklaşımlar göreli miktarda hücre yüzey işaretleyicileri ve intraselüler protein miktarının için son derece yararlı olmuştur. Ancak, çözümleme hücre içi proteinlerin hücre permeabilization yordamlar antikor erişimi etkinleştirmek için kullanımı gerektirir ve tüm hücre yüzey epitopları bu yordamları1,2hayatta. Buna ek olarak, farklı protein izoformlarının veya bölünme ürünleri arasında ayırımcılık antikorlar genellikle akış sitometresi için kullanılabilir değildir ve bu nedenle müfettişler, hala analiz türleri kesin Batı lekesi güvenmek.
Hücre lysates Western blot Analizi çoğu laboratuarlarında rutin bir işlemdir. Hücre epitopları hücre yüzey moleküllerin korumak yerel koşullar altında saf ve hücre lysates daha sonra hazırlanan ve analiz. Ancak, nüfus tarafından Western blot nadir İlköğretim hücredeki protein analizi hayvanlar yeterince hücre elde etmek için çok sayıda ötenazi gerektirebilirsiniz. Birkaç adım için küçük ayarlamalar yaparak, geleneksel Batı blotting Protokolü proteinler HSCs (500-15.000 bağlı olarak faiz protein) nispeten az sayıda tespit edebilir başardı. Doğru bir şekilde dikkatle hücre kaybı, en aza indirmek için borular arasında hücre aktarımlarını azaltma hücre Pelet işleme hücreleri, sayım ayarlamaları dahil ve hücrelerin konsantre bir yükleme ile tanımlanmış bir dizi lysing arabellek içeren proteasome ve fosfataz inhibitörleri. Yayımlanmış raporların çoğu Batı lekesi 20.000 veya daha fazla HSCs3,4,5,6,7ile elde içerir; Bu basit bir prosedür hücreleri ve deneysel hayvan 4 ve 40 kat arasında tarafından eşdeğer veri üretmek için gereken sayısını azaltır. Protokol sonuçları hücre başına bazında değil, bir iç kontrol normalleştirmek için tasarlanmıştır. Bu veri bir iç kontrol için normalleştirilmiş Eğer göz ardı edilebilir protein düzeyleri olarak genel indirim olarak algılanmasını sağlar. Bir hücre başına bazında normalize önemini gen ifadesi verileri8analiz için tanımlanmıştır ve Western blot tarafından protein miktarının aynı ilke geçerlidir. Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı herkes için az sayıda hücre analiz etmek gerek yararlı olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Western blot spesifik proteinlerin ve sinyal yolları aktivasyonu dokular veya hücreleri tespit için ortak bir tekniktir. Yaygın olarak kullanılan bir yordam ufak değişiklikler getirerek, biz düzenli olarak 15 farklı proteinler (Malzemeler tablo) 15.000 HSCs ve bazı durumlarda olabildiğince az 500 HSCs olarak tespit edebildik. The Most bu protokolündeki kritik adımlar şunlardır: 1) doğru bir şekilde hücreleri sayma, 2) tüpler arası sayısını en aza indirme ve 3) doğrudan Laemmli ör…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 CA149976 (N.A.S) Bu eser desteklenen verin.
Materials
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | SDS-PAGE |
| TEMED | Fisher Scientific | BP150-20 | SDS-PAGE |
| 30% Acrylamidel Bis solution | Bio-Rad | 1610158 | SDS-PAGE |
| 1.5M Tris-HCl pH8.8 | TEKNOVA | T1588 | SDS-PAGE |
| 1.0M Tris-HCl pH6.8 | TEKNOVA | T1068 | SDS-PAGE |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-25 | SDS-PAGE |
| mini-protean 3 comb | Bio-Rad | 1653360 | SDS-PAGE |
Mini-PROTEAN Tetra Cell |
Bio-Rad | 1658005EDU | SDS-PAGE |
| Transfer System | Bio-Rad | 1704155EDU | transfer |
| PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052EDU | electrophoresis |
| Imaging System | Bio-Rad | 1708195 | signal detection |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747EDU | sample preparation |
| 10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer | Bio-Rad | 1610732EDU | electrophoresis |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710EDU | sample preparation |
| RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots | Bio-Rad | 1704272 | transfer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | sample preparation |
| Phosphatase Inhibitor Cocktailrs | Gold Biotechnology | GB-450-1 | sample preparation |
| EIF4G | Cell signaling | 2469 | WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| p-Rps6 | Cell signaling | 4858 | WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2 |
| actin(HRP conjugated) | abcam | ab49900 | WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2 |
| LC-3 | Abcam | ab48394 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| S6 | Cell Signaling | 2317 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| 4EBP1 | Cell Signaling | 9644 | WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| p-4EBP1 | Cell Signaling | 2855 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| TSC2 | Cell Signaling | 4308 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| HSP90 | Cell Signaling | 4877 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5) |
| PTEN | Cell Signaling | 9188 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| mTOR | Cell Signaling | 2983 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-mTOR | Cell Signaling | 5536 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| PP2AB | Cell Signaling | 4953 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| p-AMPKa | Cell Signaling | 2535 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1) |
| actin | Santa Cruz | sc-47778 | WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4) |
| lineage depletion kit (mouse) | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | hematopoietic stem and progenitor cells purification |
| SCF | PeproTech | 250-03 | phosphorylation stimulation |
| APC-Cy7 c-kit antibody | ThermoFisher | A15423 | cell sorting |
| anti-B220 | ThermoFisher | 48-0452-82 | cell sorting |
| anti-CD3e | ThermoFisher | 48-0031-82 | cell sorting |
| anti-Mac1 | ThermoFisher | 48-0112-82 | cell sorting |
| anti-Gr1 | ThermoFisher | 48-5931-82 | cell sorting |
| anti-Ter119 | ThermoFisher | 48-5921-82 | cell sorting |
| Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers | Bio-Rad | 1653311 | SDS-PAGE |
| BSA | Research Products International | A30075 | membrane blocking |
| serum | Atlanta Biologicals | A12450 | medium supplement |
| cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | cell counting |
| hemocytometer | ThermoFisher | S17040 | cell counting |
| flim | Denville Scientific | E3012 | signal detection |
| medical film processor | Konica | SRC-101A | signal detection |
| Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Therom Scientific | 34096 | signal detection |
| Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A) | Beckman Coulter | X-15R | sample preparation |
| BLUEstain protein ladder | Gold Biotechnology | P007-500 | electrophoresis |
| cell sorter | BD | FACSAria II | sample preparation |
| Incublock | Denville Scientific | I0510 | electrophoresis |
Referências
- Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
- Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
- Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
- Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
- Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
- Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
- Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
- Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099 (2014).
