En In Vivo Murine iskiasnerven Model af Perineural Invasion

Summary

Vi beskriver en i vivo murine model af perineural invasion ved at indsprøjte syngeneic bugspytkirtelkræftceller i iskiasnerven. Modellen giver mulighed for kvantificering af omfanget af nerve invasion, og understøtter undersøgelse af de cellulære og molekylære mekanismer af perineural invasion.

Abstract

Kræftceller invadere nerverne gennem en proces, der kaldes perineural invasion (PNI), i hvilke kræft celler formere sig og vandrer i nerve mikromiljø. Denne form for invasion er udstillet ved en række kræft typer og meget ofte er fundet i bugspytkirtelkræft. Den mikroskopiske størrelse af nervefibre i mus bugspytkirtlen gør studiet af PNI vanskeligt i orthotopic murine modeller. Her, beskriver vi en heterotopisk i vivo model af PNI, hvor vi indsprøjte syngeneic pancreas cancer cellelinie Panc02-H7 i murine iskiasnerven. I denne model, er ischiadicus nerver af bedøvede mus udsat og injiceres med kræftceller. Kræftcellerne invadere i nerver proksimalt mod rygmarven fra punktet, injektion. Invaderede ischiadicus nerver er derefter udvundet og forarbejdet med OCT for frosne skæring. H & E og immunofluorescens farvning af disse sektioner giver mulighed for kvantificering af både graden af invasion og ændringer i protein udtryk. Denne model kan anvendes til en lang række undersøgelser af PNI givet sin alsidighed. Ved hjælp af mus med forskellige genetiske modifikationer og/eller forskellige typer af kræftceller giver mulighed for undersøgelse af de cellulære og molekylære mekanismer af PNI og forskellige kræft typer. Virkningerne af terapeutiske agenter på nerve invasion kan endvidere studeres ved at anvende behandling til disse mus.

Introduction

Nerver danne en bestemt tumor mikromiljø, der stimulerer kræft vækst og migration^1,2,3. Perineural invasion (PNI) er den proces, gennem hvilken kræft celler invadere i og omkring nerverne. Det kan betragtes som en unik rute af metastaser da kræft invasion strækker sig fra steder, hvor oprindelse langs nerverne. PNI er fundet i flere kræft typer herunder i bugspytkirtlen, prostata, hoved & hals, spyt, livmoderhalskræft, og tyktarms-og endetarmskræft med en incidens spænder fra 22% til 100%^1,2. PNI er forbundet med smerte og korrelerer med dårlig prognose og værre overlevelse satser^1,2.

Udvikling af modeller af perineural invasion er vigtigt at belyse de cellulære og molekylære mekanismer af denne proces, og at teste kandidat terapeutiske agenter for at formindske PNI. In vitro metoder til at studere samspillet mellem kræft og nerver omfatter kræftceller med nerve explants⁴, dorsalrods ganglier^5,6,7, eller med specifikke celler fælles kultur fra nerve celler mikromiljø såsom Schwann⁷. In vivo tilgange, er imidlertid mere fysiologisk relevante, omfatter anvendelse af kræft musemodeller som kræft er blevet induceret eller transplanteret og har fordel af regnskab for hele nerve mikromiljø. I orthotopic modeller af pancreas eller prostata cancer, PNI har været rapporteret^8,9,10 og forekomsten af PNI kan registreres, men på grund af den lille størrelse af nerverne i disse organer, er det svært at se den hele nerve og dermed at opgøre omfanget af PNI. Den model vi beskrive her er en i vivo model af PNI i hvilke kræft celler injiceres i iskiasnerven af mus gennem en enkel kirurgisk procedure¹¹. Heterotopisk transplantation invaderer inden for nerve mod rygmarven. Længden af nerve invasionen fra webstedet af injektion på rygmarven kan måles, og omfanget af kræft i nerve. Vigtigere, kan invaderede nerven også indsamles for en bred vifte af assays herunder mikroskopisk, og molekylære analyser. En bred vifte af kræftceller kan afprøves, og værten mus, der er blevet genetisk modificeret eller behandlet med særlige forbindelser kan bruges som godt. Denne kraftfulde assay giver mulighed for kræftceller og vært mikromiljø ændres til undersøgelse af mekanismerne af PNI.

Protocol

Alle procedurer med animalsk emner blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Memorial Sloan Kettering Cancer Center. 1. forberedelse af kræftceller Høst sub sammenflydende Panc02-H7 celler med 0,25% trypsin i 5 min ved 37 ° C. Indsamle cellerne i en 15 mL centrifugeglas.Bemærk: Cellerne dyrkes i T-225 kolbe, som indeholder omkring 12 x 106 celler pr. kolbe på 80% confluency og 4 mL trypsin / kolbe bruges. Der centrifugeres celle…

Representative Results

I denne metode beskrives kirurgisk implantation af kræft i bugspytkirtlen celler i murine iskiasnerven at oprette en i vivo model af kvantificerbare nerve invasion. Figur 1 illustrerer den anatomiske placering af iskiasnerven og injektionsstedet. Figur 2 viser to ischiadicus nerver af en nøgen mus. PBS injiceres nerve (til venstre) kan sammenlignes med en nerve sprøjtes med MiaPaCa-2 kræftceller (til højre). Nerven…

Discussion

I denne protokol beskriver vi en i vivo murine model af perineural invasion, der giver mulighed for kvantificering af iskiasnerven invasion af kræft i bugspytkirtlen celler. Denne model giver mulighed for undersøgelse af molekylære mekanismer af nerve invasion. Vellykkede eksperimenter ved hjælp af denne teknik kræver en forsigtig tilgang til tre kritiske trin i processen: 1) indsprøjtningen af kræftceller (trin 2.7, 2.8), 2) udvinding af invaderede nerver (trin 3,4), og 3) behandling af høstede nerver (…

Materials

Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1