JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Глазной кинематики, измеряется в Vitro стимуляции черепных нервов в черепаха

Published: June 02, 2018
doi:
10.3791/56864
, , ,
1Department of Biology and Neuroscience Program,Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media,Juniata College

Summary

Этот протокол описывает использование головы подготовка в vitro изолированные черепаха для измерения кинематика их движений глаз. После удаления мозга из черепной коробки могут стимулировать черепных нервов с токи для количественного определения поворотов глаз и изменения в размеры зрачка.

Abstract

После того, как умерщвлены животных, их ткани начинают умирать. Черепахи предлагают преимущество из-за длительного времени выживания их тканей, особенно по сравнению с теплокровных позвоночных. Из-за этого в vitro эксперименты в черепах может выполняться продолжительное время расследовать нервные сигналы и контроля за их целевого действия. Использование изолированных головы подготовки, мы измерили кинематика движения глаз в черепах, и их модуляции электрических сигналов осуществляется черепных нервов. После мозг был удален из черепа, оставляемого черепных нервов, расчлененный головы был помещен в карданов подвес для калибровки движения глаз. Электроды стеклянные были прикреплены к черепных нервов (глазодвигательные, trochlear и отводящего) и стимулировали с токами вызывают движения глаз. Мы наблюдает движения глаз с инфракрасной видео, системы слежения и количественных вращений глаз. Импульсы тока с диапазоном амплитуды, частоты, и поезд длительности были использованы для наблюдения за влияние на ответы. Поскольку подготовка отделены от мозга, эфферентные пути собирается целевых мышц может быть рассмотрен в изоляции расследовать нейронных сигналов в отсутствие централизованной обработки сенсорной информации.

Introduction

Обоснование использования Красноухая черепах в электрофизиологических экспериментов:

Красноухая черепахи (Красноухая scripta elegans), считаются одним из худших инвазивных видов в мире1 и может указывать, что экосистема находится в беде. Причина почему настолько успешным Красноухая черепахи плохо понял, но это может быть отчасти из-за их терпимая(ый) физиологии и владение нервной ткани, которые могут выжить в гипоксических условиях2,3,4 . Их использование для экспериментов не угрожают их числа и с минимальными усилиями, электрофизиологических препаратов может оставаться жизнеспособным в течение длительного длительностей, покуда 18 часов5,6. Преимущество похож на преимущество использования беспозвоночных животных, таких как Раки7, которые также имеют способность выдержать низкий уровень кислорода8.

Методы для измерения движений глаз:

Подходы к оценке движения глаз в лобной глазами животных, с использованием не человеческого приматов были хорошо развиты9. Глаз поворачивается на орбите вокруг трех осей: горизонтальные, вертикальные и кручения. Магнитные Поиск катушка метод обычно считается самым надежным для измерения оборотов, но является инвазивным, требующих небольших бухтах вставляется в склер животных10,11. Видео на основе системы также можно измерить вращений и преимущество неинвазивные. Разработка лучше камеры наряду с инновационной обработки повысили их функциональность, делая видео основанных систем привлекательной альтернативой для рассмотрения12,,1314.

Методы, разработанные для измерения движения глаз в nonmammals были гораздо менее значительными. Меры являются либо низким разрешением или описать только некоторые из замен15,16,17,18. Отсутствие развития может быть частично обвинен на трудность в учебных nonmammals следовать визуальных целей. Хотя движения глаз хорошо изучены в Красноухая черепахи19,20,21,,2223,24,25 ,26,27,28,29,30, из-за вызов в обучение животных для отслеживания целей, точные кинематика их движений глаз это плохо понимать.

Красноухая черепах обычно считаются боковых eyed позвоночных, но потому, что они могут полностью отказаться от их головы в их оболочки31, значительные окклюзии бокового поля зрения, панцирь происходит32. В результате получается, что их визуального линии визирования принуждается к передней, делая их ведут себя подобно лобной eyed млекопитающих. Таким образом их использования в качестве модели для разработки подходов для измерения движений глаз также предлагает уникальный эволюционной точки зрения.

Протокол, описанный в этой работе использует в vitro изолированы с головы подготовка для идентификации кинематика движения глаз в Красноухая черепах. Мозги разделяются из черепов, оставляя нетронутыми черепных нервов. Руководители помещаются в карданов подвес для калибровки движений глаз и вызывают ответы по электрической стимуляции черепных нервов, иннервирующих мышцы глаза. Меры вращений глазами выполняются системой на основе видео, используя программные алгоритмы, которые отслеживать темный зрачок и маркировку радужки. Подготовки обеспечивает возможность измерения кинематики обоих экстраокулярных (т.е., горизонтальные, вертикальные и крутильных ротаций)32 и интраокулярные (т.е., ученик изменения)33 движений.

Система модель для анализа эфферентные нервные пути:

В целом подход обеспечивает возможность учиться как эфферентные нервные сигналы генерации движения глаз, когда мышцы начинают от их расслабленной государства и в отсутствие интегрированной сенсорной информации, обработаны мозга32, следователи 33. Таким образом кинематика глаз может быть рассмотрен в модель системы, в которой они обрабатываются исключительно в эфферентной нейронные пути оставляя мозга и synapsing на мышцы.

Protocol

Примечание: Красноухая черепахи, как мужчины, так и женщин, были приобретены у поставщиков. Черепахи были размещены в теплой животных люкс, содержащий два 60-галлон ванны оснащены кирпич острова для загорать под 250-W инфракрасный свет. Окружающей среде сохранялся на 14/10-h свет/темно цикла с…

Representative Results

Рисунок 1 показывает кадры изображения взяты из видео, описывающих рассечение. Изображения обеспечивают типичные места нервов до резки от мозга. Рисунок 1: кадры изображ…

Discussion

Важнейшие шаги:

Важнейшие шаги в рамках этого протокола являются следующие: 1) вскрытие и бережно сохранить жизнеспособность пересекал нервов; 2) соответствие размеров путем всасывания электродов черепных нервов для обеспечения последовательного реагирования; и 3) размещ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят г-жи Полетт Мак-Кенна и Лиза Pezzino в этом исследовании для секретариатской поддержки и г-н Фил Ауэрбах для технической поддержки. Авторы также поблагодарить Drs. Майкл Ариэль и Майкл S. Джонс (Сент-Луиса школа медицины при университете) за представление нам подготовить в vitro изолированные головы. Финансирование для поддержки этого сотрудничества было предоставлено кафедра биологии (Роберт S. Чейз фонд), академический научно-исследовательского комитета и программе нейробиологии в Лафайет колледже. Наконец эта работа посвящена г-н Фил Auerbach, который скончался 28 сентября 2016 гг.; он выведен сканирующий электронный микроскоп и признала полезность его стадии 5-оси для использования в настоящем Протоколе. Значительно будет недоставать его дружбе и находчивость.

Materials

Red-eared slider turtles Kons Scientific Trachemys scripta elegans Large size (carapace length 15-20 cm)
Sodium chloride Sigma-Aldrich Co. LLC. S5886
Potassium chloride Sigma-Aldrich Co. LLC. P5405
Magnesium choride Sigma-Aldrich Co. LLC. M7304
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich Co. LLC. S5761
Dextrose Sigma-Aldrich Co. LLC. C5767
Concentrated hydrochloric acid Sigma-Aldrich Co. LLC. H7020
Calcium chloride Sigma-Aldrich Co. LLC. C7902
pH meter Oakton pH 6+
Suction stimulation electrode A-M Systems 573000 Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050.
Capillary glass A-M systems 626000 Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm
Alternative suction stimulation electrode A-M Systems 573050 Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm
Stereoscope Lieca GZ7 Magnification range, 10x – 70x
Fiber optic light source Amscope HL250-A 150W Fiber optical microscope illuminator light box
Rongeurs Carolina Biological Supply Company 625654 stainless steel, straight spring, 5.25"
Blunt dissection probe Carolina Biological Supply Company 627405 Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6"
Microscissors Carolina Biological Supply Company 623555 Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long
Fine forceps Sigma-Aldrich Co. LLC. F6521 Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25"
Curved forceps Sigma-Aldrich Co. LLC. Z168696 Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4"
Scalpel handle Sigma-Aldrich Co. LLC. S2896 Scalpel handles, No. 3, stainless steel
Scalpel blade Sigma-Aldrich Co. LLC. S2771 Scalpel blades, No. 11, steel
Guillotine Harvard Apparatus 73-1918 Kleine guillotine type 7575
Spatula Sigma Z648299 Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long
Hook Autozone 98069 SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth.
95/5% O2/CO2 Airgas, Inc. X02OX95C2003102 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296
Regulator Airgas, Inc. Y11244D296-AG Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette.
Adjustable airline pipe valve Doctors Foster and Smith CD-12061 Brass valve
Rigid table Unknown Unknown Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table.
5" tennis ball Petco Animal Supplies, Inc. 712868 Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door.
Alternative vibration isolation table Newport Corporation INT1-36-6-N Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6'
Gimbal ISI, International Scientific Instruments, Inc. Stage from SUPER III-A Scanning EM 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument.
Chuck for gimbal Unknown Unknown Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage
Alternative gimbal ThorLabs, Inc. GN2/M with MBT602/M Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation)
Video-based eye tracking system Arrington Research, Inc. ViewPoint EyeTracker, PC-60 Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file
Multi-position magnetic base Harbor Freight Tools Pittsburg, item #5645 Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras.
Micromanipulator Kopf 900 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation
Dissection scope on boom Lieca GZ6 Magnification range, 6.7x – 40x
Nerve/muscle stimulator Astro-Med Grass Telefactor Grass S88 Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business.
Current isolation device Astro-Med Grass Telefactor PSIU6 Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA.
Alternative nerve/muscle stimulator with isolation A-M Systems 2100 Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
  2. Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
  3. Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
  4. Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
  5. Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
  6. Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
  7. Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
  8. McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
  9. Leigh, R. J., Zee, D. S. . The neurology of eye movements. , (1999).
  10. Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
  11. Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
  12. Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
  13. Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
  14. Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
  15. Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
  16. Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
  17. Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
  18. Voss, J., Bischof, H. -. J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
  19. Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
  20. Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
  21. Balaban, C. D., Ariel, M. A “beat-to-beat” interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
  22. Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
  23. Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
  24. Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
  25. Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
  26. Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
  27. Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
  28. Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
  29. Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
  30. Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
  31. Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
  32. Dearworth, J. R., et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
  33. Dearworth, J. R., et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
  34. Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
  35. Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
  36. Romano, J. M., Dearworth, J. R. Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
  37. Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
  38. Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
  39. Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
  40. Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
  41. Maxwell, J. H., Harless, M., Morlock, H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. , 127-152 (1979).
  42. AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
  43. Clarke, R. J. Shaping the pupil’s response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
  44. Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
  45. Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).

Tags

Ocular KinematicsIn Vitro StimulationCranial NervesTurtleElectrophysiologyEye MovementsOcular-motorVision EvolutionGimbal CalibrationTurtle Ringer SolutionDissectionCranial NervesOlfactory BulbsCerebrumMidbrainOptic NerveCranial Nerve 2Cranial Nerve 3Cranial Nerve 4
check_url/pt/56864?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cano Garcia, M., Nesbit, S. C., Le, C. C., Dearworth Jr., J. R. Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle. J. Vis. Exp. (136), e56864, doi:10.3791/56864 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image