Este protocolo descreve como usar uma em vitro isolado Tartaruga cabeça preparação para medir a cinemática dos seus movimentos do olho. Após a remoção do cérebro do crânio, nervos cranianos podem ser estimulados com correntes para quantificar as rotações do olho e alterações no tamanho da pupila.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Cinemática ocular medida na Vitro estimulação dos nervos cranianos na tartaruga
Neste artigo
Resumo
Resumo
Depois que os animais são sacrificados, os tecidos começam a morrer. Tartarugas oferecem uma vantagem por causa de um maior tempo de sobrevivência de seus tecidos, especialmente quando comparado com animais vertebrados de sangue quente. Por causa disso, experimentos em vitro em tartarugas podem ser executados por longos períodos de tempo para investigar os sinais neurais e controle de suas ações de alvo. Utilizando uma preparação de cabeça isolada, Nós medimos a cinemática dos movimentos oculares em tartarugas, e sua modulação por sinais elétricos transmitido por nervos cranianos. Depois que o cérebro foi removido do crânio, deixando os nervos cranianos intacto, a cabeça dissecada foi colocada em um giroscópio para calibrar os movimentos oculares. Eletrodos de vidro foram anexados aos nervos cranianos (oculomotor, troclear e abducente) e estimulados com correntes para evocar os movimentos oculares. Temos monitorado movimentos oculares com um vídeo infravermelho quantificadas rotações dos olhos e o sistema de rastreamento. Pulsos de corrente com uma gama de amplitudes, frequências, e durações de trem foram usadas para observar efeitos nas respostas. Porque a preparação é separada do cérebro, via eferente para alvos de músculo pode ser examinada isoladamente para investigar a sinalização neural na ausência de informação sensorial centralmente processada.
Introdução
Justificativa para o uso de tartarugas-de-orelha-vermelha Slider em experimentos eletrofisiológicos:
Red-eared slider tartarugas (Trachemys scripta elegans), são considerados um dos piores espécies invasoras1 do mundo e pode indicar que um ecossistema está em apuros. A razão por que as tartarugas-de-orelha-vermelha deslizante são tão bem sucedidas é mal compreendida, mas pode ser em parte devido a sua fisiologia tolerante e posse dos tecidos nervosos que podem sobreviver sob condições de hipóxia,2,3,4 . Usá-los para ex....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Nota: As tartarugas-de-orelha-vermelha deslizante, tanto masculinas como femininas, foram compradas de um fornecedor. As tartarugas foram alojadas em uma suíte de animal quente contendo duas cubas de 60 galões equipadas com ilhas de tijolo para bronzear-se sob luzes infra-vermelhas 250-W. O ambiente manteve-se em um ciclo claro/escuro de 14/10-h com a temperatura da água a 22 ° C. As luzes foram ligadas às 06:00 e desligadas às 20:00. Os tanques equipados com sistemas de filtragem foram limpos semanalmente, e tartarugas foram alimentadas ad libitum com todos os outros dias. Os cuidados de slider vermelho-eared tartarugas e todos os seguintes procedimentos exp....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A Figura 1 mostra fotografias de imagens tiradas de um vídeo descrevendo a dissecação. Imagens fornecem lugares típicos dos nervos antes da corte do cérebro.
Figura 1: Stills de imagens capturadas do vídeo da dissecação para mostrar a localização do nervo óptico (nII), nervo oculomotor (nIII), nervo troclear .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Passos críticos:
Os passos críticos neste protocolo são os seguintes: 1) a dissecção e o cuidado de manter a viabilidade dos nervos necrosante; 2) a correspondência de tamanhos pelos eletrodos de sucção para os nervos cranianos para fornecer respostas consistentes; e 3) o posicionamento da cabeça no cardan para fornecer a calibração adequada das rotações do olho.
Solução de problemas:
A dissecação pode ser desafiador, mas depois de completá-la .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores Obrigado Sra. Paulette McKenna e Lisa Pezzino neste estudo para apoio de secretariado e Mr. Phil Auerbach para suporte técnico. Os autores também agradecer os Drs Michael Ariel e Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) por nos apresentar a preparação cabeça em vitro isolado. Financiamento apoio desta colaboração foi fornecido pelo departamento de biologia (Robert S. Chase Fund), o Comité de investigação académica e programa de neurociência da faculdade de Lafayette. Por último, este trabalho é dedicado ao Sr. Phil Auerbach, que faleceu a 28 de setembro de 2016; Ele descomissionado um microscópio eletrônico de varredura e reconh....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tartarugas-de-orelhas-vermelhas | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Tamanho grande (comprimento da carapaça 15-20 cm) |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
| Cloreto | de potássio Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
| Ácido clorídrico concentrado | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Cloreto | de cálcio Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
| Medidor de pH | Oakton | pH 6+ | |
| Eletrodo de estimulação de sucção | A-M Systems | 573000 | Eletrodo de sucção bipolar. Observe que 573000 foi substituído por 573050. |
| Vidro capilar | Sistemas A-M | 626000 | Vidro capilar de borossilicato de barril único sem microfilamento, comprimento 10 cm, diâmetro externo 1,0 mm, diâmetro interno 0,50 mm |
| Eletrodo de estimulação de sucção alternativo | A-M Systems | 573050 | Eletrodo de sucção bipolar. Requer vidro capilar de diâmetro maior: 627000, diâmetro externo 1,2 mm, diâmetro interno 0,68 mm |
| Estereoscópio | Lieca | GZ7 | Faixa de ampliação, 10x - 70x |
| Fonte de luz de fibra óptica | Amscope | HL250-A | 150W Microscópio de fibra óptica iluminador caixa de luz |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | aço inoxidável, mola reta, 5,25" |
| Sonda de dissecação sem corte | Carolina Biological Supply Company | Sonda de | shopping 627405 Huber, sonda de ponta dupla e buscador, 6 " |
| Microtesoura | Carolina Biological Supply Company | 623555 | tesoura de microdissecação de íris, aço inoxidável, lâminas de 0,5", pinça fina de 4,75" de comprimento |
| Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Pinça de joalheiros, dumont No. 5, liga inox, pinça curva de 4,25" | |
| Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Ponta média, pinça curva, aço inoxidável, | |
| cabo de bisturi | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Cabos de bisturi, nº 3, lâmina de bisturi de aço inoxidável |
| Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Lâminas de bisturi, nº 11, | |
| aço Guilhotina | Harvard Aparelho | 73-1918 | Guilhotina Kleine tipo 7575 |
| Espátula | Sigma | Z648299 | Conjunto de pesagem de micro colher e espátula. Use uma espátula pequena: 5,9" de comprimento x 0,07 " Diâmetro do punho com extremidade quadrada: 0,17 " x 1,3" longo, outra extremidade redonda: 0,17 " x 1,27" Gancho longo |
| Autozone | 98069 | Conjunto de gancho e palheta SureBilt. Use o moedor para embotar as pontas afiadas do gancho para evitar ferimentos na boca dos animais. | |
| 95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | Mistura de gás padrão certificada de oxigênio de equilíbrio de dióxido de carbono de 5%, tamanho 200 Cilindro, Regulador CGA-296 |
| Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Regulador de cilindro analítico de latão de estágio único 0-100 psi CGA-296 com saída de agulha. Use a válvula de tubo de linha aérea ajustável de latão para ir de 3/8 ", diâmetro interno, tubo de vinil conectado ao regulador para uma conexão de linha aérea de 3/16 ", diâmetro interno, indo para airstone ou pipeta de pasteur de vidro. | |
| Válvula de tubo de linha aérea ajustável | Doctors Foster e Smith | CD-12061 | Válvula de latão |
| Mesa rígida | Desconhecido Desconhecido | Porta de autoclave colocada em cima de uma mesa robusta. Nove bolas de tênis de 5" de diâmetro isolam as vibrações da superfície superior da mesa. | |
| Bola de tênis de 5" | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Bola de tênis Petco Jumbo Pet: as bolas não são cortadas e mantidas dentro de uma estrutura integrada na parte inferior da porta da autoclave. |
| Mesa alternativa de isolamento de vibração | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Sistema de controle de vibração rígido, integridade 1: Dimensões da superfície, 3' x 6'Gimbal |
| ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Platina de SUPER III-A Scanning EM | Platina eucêntrica de 5 eixos: movimentos lineares X, Y e Z, ± 20 mm, precisão de 0,1 mm; Rotações verticais, ± 10°, e horizontal, ± 12,5 graus, com 1,25 graus; precisão. Nota: do instrumento de desativação. | |
| Mandril para gimbal | Desconhecido | Desconhecido | O mandril de um micrótomo antigo de fabricação desconhecida foi usinado para caber no eixo do suporte de amostra do estágio Scanning EM |
| Gimbal alternativo | ThorLabs, Inc. | GN2/M com MBT602/M | Goniômetro de eixo duplo (GN2/M) montado em estágio de microbloco de 3 eixos com ajustadores de parafuso de aperto manual (MBT602/M): projete um mandril para segurar a cabeça da tartaruga com o olho a 12,7 mm acima da superfície superior do goniômetro (distância até o ponto de rotação) |
| Sistema de rastreamento ocular baseado em vídeo | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Método de rastreamento: Vídeo infravermelho por pupila escura; Câmera em preto e branco (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; Requisitos do sistema: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Alcance visual: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Precisão ~0.5°; Resolução espacial ~0,15°; Resolução do tamanho da pupila ~0,03 mm; Dados oculares: posição X, Y do olhar, altura e largura da pupila, torção, tempo delta, tempo total e regiões de interesse (ROI); Comunicação em tempo real (Item 0022): 4-Channel AnalogOut com oito canais de entrada TTL para marcar códigos no arquivo |
| de dados Base magnética multi-posição | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | O suporte magnético atinge até 12" e produz 45 lbs. de tração magnética. Use para posicionar a câmera. Faça furos de rosca na extremidade da haste para montar câmeras. |
| Micromanipulador | Kopf | 900 | Manipulação de 5 eixos para montagem de eletrodo de sucção: X, Y, Z curso linear, 2 eixos de rotação |
| Escopo de dissecção na lança | Lieca | GZ6 | Faixa de ampliação, 6,7x - 40x |
| Estimulador de nervo/músculo | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Estimulador de tensão de pulso duplo: dois canais de saída que podem ser operados de forma independente ou sincronizados para gerar pulsos de tensão constante não isolados (10 mv a 150 V). Os pulsos podem ser únicos (10 μ seg a 10 seg), repetitivo (0,01 Hz a 1 KHz) e trens (1 ms a 10 s) e sincronizado com entradas e saídas TTL. Envie saídas TTL através dos canais de saída de um conector DB25 para os canais de entrada TTL do ViewPoint EyeTracker. Observação: O Telefator de Grama Astro-Med não está mais no mercado. |
| Dispositivo de isolamento de corrente | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Unidade de isolamento de estímulo de corrente: permite o fornecimento seguro de correntes constantes pelo S88 para a preparação. O PSIU6 se conecta por um cabo BNC a um dos canais de saída do S88. Os interruptores multiplicadores no PSIU6 permitem que o S88 gere uma ampla gama de amplitudes de corrente que variam de 0,1 e micro; A a 15 mA. |
| Estimulador alternativo de nervos/músculos com isolamento | A-M Systems | 2100 | Estimulador de pulso isolado: A unidade possui isolador embutido para produzir correntes constantes. |
Referências
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
