בדיית משטחי זכוכית אופטית באיכות ללמוד פיוז'ן מקרופאג
Summary
פרוטוקול זה מתאר הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות הספוחה עם תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים יכול לשמש כדי לפקח פיוז’ן מקרופאג של דגימות החיים ומאפשרת סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של דגימות קבוע .
Abstract
להמחיש את היווצרות תאי ענק multinucleated (MGCs) מן החי דגימות מאתגרת בשל העובדה כי ביותר טכניקות הדמיה בשידור חי דורשות הפצת האור מבעד לזכוכית, אבל על זכוכית פיוז’ן מקרופאג הוא אירוע נדיר. פרוטוקול זה מציג הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות מספר היכן ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים הופכת זכוכית משטח fusogenic. ראשית, הכנה של משטחי זכוכית נקי כמתחילה חומר עבור שינוי פני השטח המתואר. שנית, שיטת מסופק עבור ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים להמרת הלא-fusogenic זכוכית מצע fusogenic. שלישית, פרוטוקול זה מתאר ייצור של micropatterns משטח המקדמים רמה גבוהה של שליטה ייתכן על היווצרות MGC. לבסוף, בדיית כלי הזכוכית התחתונה מתואר. דוגמאות לשימוש במבחנה התאים במערכת זו כמודל ללמוד פיוז’ן מקרופאג ויצירת MGC מוצגים.
Introduction
היווצרות של MGCs מלווה מספר מצבים פתולוגיים בגוף האדם מכובד על ידי דלקת כרונית1. למרות הסכם זה mononucleated מקרופאגים הפתיל טופס MGCs2, אך מספר מחקרים הראו היתוך בהקשר עם חיים דגימות3,4. זה בגלל משטחי זכוכית נקי הנדרשים עבור רוב טכניקות הדמיה לא לקדם פיוז’ן מקרופאג כאשר המושרה על ידי ציטוקינים דלקתיים5. אכן, אם זכוכית נקי משמש מצע פיוז’ן מקרופאג, ואז נמוך מטרות ביניים ההגדלה (קרי, X 10-20), יותר מ 15 h של רציפות הדמיה לעיתים קרובות נדרשים לקיים אירוע יחיד פיוז’ן.
על יד אחרים, משטחי פלסטיק fusogenic (למשל, permanox) או כיתה בקטריולוגית פלסטיק לקדם פיוז’ן2. עם זאת, הדמיה דרך פלסטיק הוא בעייתי, כיוון המצע עבה, מחליקי אור. זה מסבך הדמיה מאז זמן עבודה מרחק (LWD) מטרות נדרשים. עם זאת, המטרות LWD יש בדרך כלל איסוף קיבולת לעומת עמיתו שלהם תוקן coverslip אור נמוכה. יותר, טכניקות לנצל שינויים הקוטביות של האור עובר דרך הדגימה כגון התערבות דיפרנציאלית ניגודיות הם בלתי אפשרי מאחר פלסטיק הוא birefringent. המחסומים הקשורים לשימוש של פלסטיק בעץ־תה עוד יותר העובדה כי זה בלתי אפשרי לחזות איפה היווצרות MGC/פיוז’ן מקרופאג תתרחש על פני השטח. יחד, מגבלות אלה להגביל את החזיית פיוז’ן מקרופאג כדי שלב אופטיקה חדות, מורחב הכולל משכים הדמיה (> 15 שעות רצוף), ברזולוציה נמוכה.
לאחרונה זוהו משטח זכוכית fusogenic מאוד כשניצח מיקרוסקופ ברזולוציה סופר יחיד מולקולה עם קבוע מקרופאגים/MGCs4. התבוננות זו היה מפתיע כי לנקות זכוכית משטחים לקדם פיוז’ן בקצב נמוך מאוד של ~ 5% לאחר 24 שעות בנוכחות אינטרלוקין-4 (IL-4) כפי שנקבע על ידי היתוך גרעיני אינדקס4. מצאנו כי היכולת לקדם פיוז’ן היה עקב זיהום oleamide. ספיחה של oleamide או תרכובות אחרות שהכיל באופן דומה ארוכי שרשרת פחמימנים עשה את fusogenic זכוכית. רוב fusogenic מורכבים (פרפין) הייתה micropatterned, שהצפיפות רמה גבוהה של שליטה ייתכן פיוז’ן מקרופאג עלייה 2-fold מספר האירועים פיוז’ן נצפתה בתוך אותה כמות זמן בהשוואה permanox. משטחים אלה איכות אופטית סיפק הצצה ראשונה לתוך מורפולוגיות ו קינטיקה המפקחים על היווצרות של MGCs ב חי דגימות.
ב פרוטוקול זה אנו מתארים את ייצור מגוון רחב של משטחי זכוכית זה יכול לשמש כדי לפקח על היווצרות של MGCs מן החי דגימות. בנוסף, אנו מראים כי משטחים אלה נתונות שיטות סופר-זיהוי רחוק-שדה. משטח פבריקציה נוספת תלויה מטרת הניסוי, כל השטח המתואר בדוגמאות הקשורות בטקסט שתמשיך.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצורך לזהות ולפתח לאחר מכן משטחי זכוכית אופטית באיכות המקדמים פיוז’ן מקרופאג נבע מן העובדה עד מחקר שפורסם לאחרונה לא ישירות דמיינו פיוז’ן מקרופאג בהקשר של חיים דגימות3, 4. זה בשל העובדה כי משטחי פלסטיק fusogenic המשמשים בדרך כלל דורשים LWD מטרות, מוגבלות במידה רבה …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מאחלים להודות חברים של Ugarova מעבדה, חוקרים במרכז על חילוף החומרים וביולוגיה וסקולרית לדיון מועיל של עבודה זו. ג’יימס פאוסט מבקש להביע את תודתי כדי המדריכים בקורס האירופי לביולוגיה מולקולרית מעבדה סופר רזולוציה מיקרוסקופיה של בשנת 2015. אנו רוצים להודות Khuon הילה זיו-Janelia על העזרה עם הכנת הדוגמא עבור LLSM. במהלך הסקירה ואת הצילומים חלקים של עבודה זו ג’יימס פאוסט נתמכה על ידי מלגת T32 (5T32DK007569-28). המרכיב סריג אור גיליון של עבודה זו נתמכה על ידי HHMI ואת בטי גורדון מור קרן. T.U. ממומן על ידי NIH הענק HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
Referências
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
