Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.
A agregação da proteína é uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela). Agregados de proteína estão intimamente associados com neuropatologia destas doenças, embora o mecanismo exato pelo qual a agregação da proteína aberrante interrompe a homeostase celular normal não é conhecido. Emergentes dados fornecer forte apoio para a hipótese que agregados patogénicos em AD, PD, HD, e ALS tem muitas semelhanças com os prions, que são somente proteína agentes infecciosos responsáveis para as encefalopatias espongiformes transmissíveis. Priões auto replicam por modelagem a conversão das versões nativamente-dobrado da mesma proteína, causando a propagação do fenótipo agregação. Como príons e proteínas de príon, como no anúncio, PD, HD e ALS mover de uma célula para outra é atualmente uma área de intensa investigação. Aqui, um modelo de Drosophila melanogaster que permite o monitoramento da transmissão príon-like, célula a célula do mutant huntingtin (Htt) agregados associados com HD é descrito. Este modelo aproveita-se de poderosas ferramentas para manipular a expressão do transgene em muitos tecidos diferentes da drosófila e utiliza uma proteína citoplasmática marcados fluorescentemente diretamente transferência de prião, como relatório de mutante Htt agregados. Importante, a abordagem que descrevemos aqui pode ser usada para identificar novos genes e vias que medeiam o espalhamento de agregados de proteínas entre célula diversos tipos em vivo. Informações obtidas a partir desses estudos irão expandir a compreensão limitada dos mecanismos patogénicos que fundamentam a doenças neurodegenerativas e revelar novas possibilidades de intervenção terapêutica.
A hipótese do príon afirma que o agente infeccioso responsável para as encefalopatias espongiformes transmissíveis (por exemplo, doença de Creutzfeldt – Jakob nos seres humanos, o tremor epizoótico dos ovinos, doença desperdiçando crônica em cervos e alces e “doença da vaca louca” em bovinos ) é unicamente composto de proteína e desprovidos de ácidos nucleicos1. Em doenças de príon, a proteína príon celular (PrPC) pressupõe uma dobra não-nativas, estável (PrPSc) que é altamente beta folha-rico e pode propagar self convertendo e recrutamento monomérico PrPC moléculas em amiloide estável agregados. PrPSc agregados usam esse mecanismo de auto-replicação para espalhar entre diferentes células em um organismo e mesmo entre organismos individuais2.
Enrolamento de proteínas e agregação é também uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas (a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela))3. Formação das assembleias intra ou extra cellular agregados da proteína nestas doenças está intimamente associada com a citotoxicidade4 e progride ao longo de caminhos altamente reprodutíveis e doenças específicas, através do cérebro ao longo do tempo5, 6. estes padrões de propagação sugerem que agregados patogénicos associados a esses transtornos tem príon-como propriedades. Forte apoio agora existe para transmissão de príons, como dos agregados associados AD, PD, HD e ALS – espalham de célula para célula e modelo a mudança conformacional monomérico formas da mesma proteína em células anteriormente afetado7, 8.
A maioria dos estudos investigando o prião, como propagação de agregados de proteínas até à data têm sido realizada usando modelos de cultura de células de mamíferos, onde agregados transferir para o citoplasma das células ingênuo do espaço extracelular ou de outra célula citoplasma9,10,11,12,13,14,15, ou pela injeção de material agregado contendo em cérebro de rato e monitoramento agregar aparência fora a injeção local16,17,18,19,20,21,22, 23. mais recentemente, os animais transgénicos têm sido utilizados para demonstrar que agregados intracelulares se espalhar para outras células no cérebro intacto24,25,26,27, 28,29,30. Aqui, descrevemos um método para a visualização directa de transferência agregada entre células individuais do cérebro intacto de Drosophila melanogaster. Drosófila modelos de HD/polyglutamine (polyQ) doenças foram desenvolvidos primeiramente há quase duas décadas de31,32 e forneceram muitos insights inestimáveis sobre os mecanismos patogénicos subjacentes a estes distúrbios 33. HD é uma desordem neurodegenerativa hereditária causada por uma mutação autossômica dominante no gene que códigos para a proteína huntingtina (Htt)34. Esta mutação resulta na expansão de um trecho de polyQ perto N-terminal do Htt, além de um limite de patogenicidade de ~ 37 glutaminas, fazendo com que a proteína misfold e agregado35,36. Proteínas de Htt do selvagem-tipo contendo < 37 glutaminas neste estiramento alcançar seu aprisco nativo, mas pode ser induzidas a agregada ao contacto físico directo com um Htt agregada "semente"12,,27,37. Exploramos este homotypic, nucleada agregação do selvagem-tipo Htt como uma leitura para transferência de príon-como e citoplasmática entrada dos mutantes Htt agregados originários de outras células.
Determinar os mecanismos pelos quais agregados de príon-como viagens entre células podem levar à identificação de novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas incuráveis. Levamos vantagem do ciclo de vida rápido, facilidade de uso e rastreabilidade genética da Drosophila melanogaster para definir mecanismos moleculares para propagação de célula para célula do mutant Htt agregados. Nossa estratégia experimental emprega dois sistemas de expressão binário disponíveis em Drosophila, o bem-estabelecida Gal4 específicas upstream ativando sequência (Gal4-UAS) sistema38 e o recentemente desenvolvido QF-QUAS sistema39. Estes dois sistemas independentes de acoplamento permite restringir a expressão dos mutantes e selvagem-tipo Htt transgenes para populações de células distintas dentro da mesma voar40. Usando essa abordagem, nós examinamos príon como difusão do mutant Htt, monitorando a redistribuição de citoplasmática Htt selvagem-tipo de estado solúvel, normalmente difuso a um estado de agregados, uma consequência direta do contato físico com um mutante pré-formado Htt agregado “semente”. Conversão de tipo selvagem Htt por mutant Htt pode ser confirmado usando bioquímicas ou transferência de técnicas biofísicas que relatam as interações da proteína-proteína, tais como energia de ressonância de fluorescência (FRET)9,,27,41 .
Importante, também podemos acessar um grande número de ferramentas genéticas em Drosophila para identificar genes e/ou caminhos que medeiam príon como propagação de agregados de proteínas. Temos recentemente usado essa abordagem para desvendar um papel-chave para o receptor de superfície ao tesouro de célula,42,Draper43, na transferência de mutante Htt agregados de axônios neuronais para glia fagocítica nas proximidades em Drosophila central sistema nervoso (SNC)27. Assim, a abordagem genética e imagem latente-baseada que descrevemos aqui pode revelar importantes informações biológicas básicas sobre um fenômeno doença relevantes no simples de usar mas organismo modelo poderoso, Drosophila.
Como o número de pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas continua a aumentar, há uma necessidade urgente de aumentar a compreensão da patogênese molecular dessas doenças para que melhor terapias podem ser desenvolvidas. Aqui, descrevemos os métodos que permitem a monitorização do prião, como transmissão de agregados de proteínas patogênicas entre diferentes tipos de células no organismo modelo, Drosophila melanogaster. Recentemente usamos esta metodologia para demonstrar prião, como tra…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a membros dos laboratórios Kopito, Luo e Pearce para muitas discussões útil durante o desenvolvimento desses métodos. Agradecemos também o Brian Temsamrit pela leitura crítica deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos da Universidade das Ciências e as confianças Charitable W.W. Smith.
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
LAS X image analysis software | Leica | ||
Imaris image analysis software | Bitplane |