Zika smitte av kultivert menneskelig fosterets hjerne nevrale stamceller for Immunocytochemical analyse
Summary
Denne artikkelen omhandler metodene som brukes til å utvide menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller i kultur, samt hvordan å skille dem i ulike neuronal subtyper og astrocyttene, med hovedvekt på bruk av nevrale stamceller å studere Zika virusinfeksjon.
Abstract
Menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller er en unik ikke-genmodifisert modell-system for å studere virkningen av ulike stimuli på menneskelig utviklingsmessige nevrobiologi. Heller enn å bruke en dyremodell eller genmodifiserte indusert pluripotent celler, gir menneskelige embryonale stamceller en effektiv i vitro system for å undersøke effektene av behandlinger, skjermen narkotika, eller undersøke individuelle forskjeller. Her gir vi detaljerte protokollene for metoder brukes til å utvide menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller i kultur med serum-frie medier, å skille seg ut forskjellige nevrale subtyper og astrocyttene via forskjellige grunning prosedyrer, og å fryse og gjenopprette disse cellene. I tillegg beskriver vi en prosedyren for bruk av menneskelige fosterets hjerne nevrale stamceller Zika virusinfeksjon.
Introduction
Zika virus (ZIKV) er en flavivirus overføres seksuelt, eller av mygg vektorer Aedes aegypti og Aedes albopictus myggen. ZIKV nylig ble oppdaget som en alvorlig folkehelsen trussel på grunn av sin brukervennlighet overføring og tilknyttet nevrologiske symptomer1. En av mest om nevrologiske effekter er utviklingen av microcephaly i fostre født infiserte graviditet2,3. Microcephaly er en neurodevelopmental lidelser der hodet er mindre enn vanlig størrelse under fosterutvikling og fødsel omkretsen mindre enn 2 standardavvik under mener4. Den mindre hodeomkrets er vanligvis ledsaget av en rekke samtidige som utviklingsmessige forsinkelser, beslag, visjon og hørselstap og fôring problemer.
Nyere studier har brukt dyremodeller eller indusert pluripotent stamceller å studere effekten av ZIKV på neurodevelopment5,6,7,8. Mens disse studiene har bidratt til vår kunnskap om ZIKV, bruk av ulike arter eller genmodifiserte celler kan være tidkrevende og/eller legge til flere variabler som kan forvirre effekten av ZIKV på celler utvikling av neural5, 6 , 7 , 8. problemer med hNSC kultur, særlig ikke-tilhenger neurosphere kulturen beskrevet i denne protokollen, er imidlertid at kulturen er svært følsomme for metodene som brukes til å gjennomføre kultur9. Endringer i mellomstore komponenter eller selv den fysiske håndteringen av kultur fartøyet, er nok til å lokke fram en reaksjon fra celler9. For å løse disse problemene, utviklet vi en i vitro menneskelige fosterets hjerne-avledet nevrale stamceller (hNSCs) kultur for å avhøre mechanistically effekten av ZIKV på fetal nevrale stamceller. Bruke våre metoden ble hNSCs opprettholdt for over 80 passasjer uten tilsynelatende fenotypiske endringer10. Videre chromosomal endringer som trisomy var enten ingen eller minimal11. HNSC kultur vokser som en ikke-tilhenger neurosphere kultur. En fordel med neurospheres er at kulene opprette en unik miljømessige nisje i kultur som er mer reflektert i vivo nisjer i forhold til todimensjonal kulturer9. En annen fordel med denne protokollen er at flere celletyper kan utledes fra hNSC kultur, slik at en etterforsker å observere virkningen av en gitt variabel hNSC overlevelse og differensiering. Denne protokollen gjelder personer ute for å svare mekanistisk spørsmål angående sentralnervesystemet utvikling eller dysfunksjon. Følgende protokollen beskriver hvordan å utvide en hNSC kultur for å infisere med ZIKV, og deretter skille hNSCs å observere virkningen av infeksjon på differensiering prosessen. Det inkluderer også lagre hNSCs for langsiktig bruk, og å skille hNSCs i ulike typer nerveceller som tillate ytterligere undersøkelse av ZIKV-indusert underskudd bidra til hjernen misdannelse11. Vi tror denne protokollen er også av interesse for etterforskere søker å forstå virkningen av eventuelle miljømessige stimulans som infeksjon eller giftstoffer på nevrale stamceller overlevelse og differensiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kultur og manipulere hNSCs gir et kritisk verktøy som kan brukes til en rekke formål fra modellering menneskelig sykdom til høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening10,11,12,14, 15,16,17. Mange spørsmål gjensto å bli behandlet som hvordan menneskelige fosterets hjerne NSCs el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av midler fra John S. Dunn Foundation og Institutt for menneskelige infeksjoner og immunitet av University of Texas Medical Branch (pw).
Materials
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
Referências
- Centers for Disease Control and Prevention. . All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission – Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. . Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
