Vi presenterar en ny metod för att karakterisera tumörceller. Vi kombinerade immunofluorescens med DNA fluorescerandein situ-hybridisering att utvärdera celler fångas av en functionalized medicinsk tråd kan i vivo berikande CTCs direkt från patientens blod.
Cirkulerande tumörceller är (CTCs) associerade med dålig överlevnad i metastaserande cancer. Deras identifiering, fenotypning och genotypning kunde leda till en bättre förståelse av tumör heterogenitet och därmed underlätta urvalet av patienter för individualiserad behandling. Detta hämmas dock på grund av sällsynthet av CTCs. Vi presenterar en innovativ metod för provtagning en hög volym av patientens blod och att erhålla information om närvaro, fenotyp och gen flyttning av CTCs. Metoden kombinerar immunofluorescens färgning och DNA fluorescerandein situ-hybridisering (DNA fisk) och bygger på en functionalized medicinsk tråd. Denna wire är en innovativ produkt som tillåter i vivo isolering av CTCs från en stor volym av perifert blod. Blodvolymen säkerhetskontrolleras med en 30-min administration av tråd är cirka 1,5-3 L. För att demonstrera genomförbarheten av denna strategi, epitelial cell adhesion molekyl (EpCAM) uttryck och det kromosomala translokationen av ALK-genen bestämdes i icke-småcellig lungcancer (NSCLC) cancer cellinjer fångas av functionalized tråd och målat med ett immuno-DNA fisk förhållningssätt. Vår största utmaning var att utföra analysen på en 3D-strukturen, functionalized tråd, och att fastställa immuno-fenotyp och fisk signaler på detta stöd med konventionella fluorescens Mikroskop. Resultaten tyder på att fånga CTCs och analysera sin fenotyp och kromosomala rearrangering potentiellt kunde representera en ny följeslagare diagnostisk metod och ge en innovativ strategi för att förbättra personlig cancerbehandlingar.
CTCs utgör ett viktigt steg för cancer cell spridning1. Deras närvaro i perifert blod av patienter är associerade med (metastaserad) återfall och sjukdom progression2,3. CTC isolering och karakterisering från blodet av cancerpatienter är en typ av icke-invasiva flytande biopsi. Under de senaste åren har det blivit alltmer uppenbart att övervakning av sjukdomsprogression och respons av tumörer på olika behandlingar med denna slags analys ger viktig klinisk information4,5. Flytande biopsi är ännu mer användbara när kirurgi inte är möjlig eller när primärtumör vävnad inte är tillgänglig, dvsför icke-biopsiable lesioner. Detta tillvägagångssätt är därför lovande i specifika cancer inställningar såsom metastaserande NSCLC, där förekomsten av CTCs har visat sig ha en negativ prognostisk roll6. NSCLC är en tumör som gynnar särskilt från riktade behandlingsmetoder7,8,9 konstruerad för att fungera på specifika molekyler (molekylära mål) kända för att vara inblandade i tillväxten, progression, och spridningen av sjukdomen. Därför krävs påvisande av specifika mål under sjukdomsförloppet. CTC undersökning är en extremt intressant diagnostiska metod att upptäcka och övervaka läkemedelsmål utan behov av primär eller metastaserad vävnader. Till exempel är upptäckt av ALK-genen flyttningar i NSCLC celler associerad med känslighet för crizotinib, en särskild riktad terapi10. Dock för närvarande utförs detektion av ALK flyttningar endast på fin nål aspirerade eller små biopsier; som ett resultat, utan en tumör är vävnad ALK analys inte möjligt. CTCs är en potentiella alternativ till tumör tissue-baserade utredningar och representerar ett mycket lovande följeslagare diagnostiska tillvägagångssätt.
Trots deras potentiella betydelse är CTCs fortfarande föremål för stor debatt bland forskning, främst på grund av deras raritet (1-10 celler/mL i perifert blod11). Nuvarande flytande biopsi metoder använder en begränsad mängd blod (dvs, 1-30 mL)12,13, men detta skapar en situation av suboptimal känslighet för detektion av CTCs. därav, forskning är motiverad till att hitta metoder och utveckla enheter utföra CTC-riktade flytande biopsier på en större volym av perifert blod.
En alternativ enhet, en functionalized medicinsk tråd (se Tabell för material), har utvecklats för att övervinna blod provtagning begränsningar och få en mer representativ analys av CTCs. Detta functionalized wire är en CE-godkänd medicinteknisk produkt som fångar CTCs direkt från blodet av cancer patienter1. Den består av en 16 cm lång rostfri tråd (figur 1a) med 2 cm långa functionalized spets belagd med ett 0,2 µm-tjocka lager av guld. Lagret är i sin tur omfattas av en 1-5 µm tjock polykarboxylat hydrogel stratum kovalent tillsammans med antikroppar riktade mot EpCAM, en av de mest uttryckt antigenerna på ytan av CTCs14. Functionalized spetsen av tråd introduceras i en ven i armen av patienten och förblir i position i minst 30 min. Detta synsätt gör isolering av CTCs in vivo direkt i perifert blod och till skärmen ca 1,5-3,0 L blod (cirka 300-fold mer än volymen används för alternativa metoder)1.
Pantel et al. visade effekten av detta tillvägagångssätt isolera CTCs direkt i arm venerna i lung cancer patienter15. De utförde tråd immunofluorescens färgning för att identifiera CTCs använder konventionella antikroppar riktade mot EpCAM och pan-cytokeratin, och CD45 för leukocytbefriade upptäckt. Tråden undersöktes under en optisk fluorescens Mikroskop15. Författarna visade att enheten var kunna isolera CTCs, men de inte undersöka alla terapi-relaterade mål, såsom ALK flyttningar.
Den presenterade metoden syftar till att identifiera förmodad CTCs i NSCLC cellinjer utifrån fenotypiska parametrar, t.ex., EpCAM positivitet och förekomsten av molekylära markörer, exempelvis ALK status (figur 1b). Proceduren 3-dag-långa kombinerar en functionalized tråd och immunofluorescens färgning med DNA fluorescensin situ-hybridisering (DNA fisk), heter Immuno-DNA-fisk. CTCs är sällsynta enheter, är fördelen med detta protokoll att CTCs kan karaktäriseras på samma tråd när det gäller både immunophenotypic funktioner och DNA omflyttningar.
I detta papper, för första gången, en metod som kombinerar immunofluorescens färgning och DNA fisk, för användning med functionalized tråd föreslogs. Metoden kallades Immuno-DNA fisk. Denna teknik utvecklades tillåta samtidig identifiering av förmodad CTCs på en 3D tråd utifrån fenotypiska parametrar, såsom positivitet till EpCAM (fall 1), och underlätta upptäckt av molekylära förändringar, såsom ALK-genen status) (händelse 2). Samtidiga identifiering av två händelser kan påvisande av deras samtidig localization. Detta tillvägagångssätt kan därför skräddarsys för att identifiera och karaktärisera CTCs Hämtad från blodet av cancerpatienter. De potentiella effekterna av Ante-komponenter och leukocyter på färgningsproceduren stör inte vanligtvis förfarandet. Uppgifter som rapporterats i litteraturen anges särskilt att Ante-komponenter och leukocyter inte påverkar immunofluorescens färgningen av cellerna bifogas tråd, den kritiska steget att identifiera faktiska CTCs1,15.
Fluorescens ljusstyrka Immuno-DNA fisk är något mindre markant än en traditionell immunophototyping assay och är resultatet av den höga temperaturen behövs för fisk analysen. Det är dock fortfarande märkbar immunofluorescens färgning. En svag signal är exempelvis fortfarande spåras i den låga EpCAM-uttryckande cellinje, NCIH1975. Den höga temperatur som krävs för fisk analysen är den viktigaste begränsande faktorn i valet den rätt fluorokrom kopplade till antikroppen. I detta protokoll, måste antikroppar kopplas till en termostabila fluorokrom för att tolerera DNA denaturering temperaturen. Till exempel rekommenderas inte fykoerytrin, en värmekänslig fluorokrom, i den här inställningen på grund av fluorokrom nedbrytning, orsakad av hög temperatur. Fluorescein isotiocyanat är ett bra val och ofta gemensamma fluorokrom anställd på fisk sonder. Immuno-DNA fisk autofluorescens signalen är mycket dålig på standard 2D stöd. På tråd stöd, kan polymerskikt inducera en liten autofluorescens signal, särskilt på den röda kanalen. Till skillnad från 2D bakgrunden, en ett bakgrund signal kan skönjas på tråd men påverkar inte signifikant atomkärnor identifiering eller cell karakterisering.
Mikroskopet utvärdering av tråden är mycket mer tröttande än på en 2D stöd på grund av gränserna för ett optiskt mikroskop i läsning på ytan av en cylindrisk-formade 3D-strukturen. Denna svårighet kan dock lösas genom roterande tråd innehavaren och de bilder som är främst lokaliserade längs mittlinjen av tråd. Tråd innehavaren tillåter en 360 ° rotation av tråd. När fokuserade på atomkärnor, hålla fluorescens kanalbyte inte nödvändigtvis fokus på målområdet. Därför är det viktigt att behålla fokus på inner-cell målområdet.
Denna teknik kan skräddarsys för att upptäcka och karaktärisera celler på olika typer av 3D stöd. Det kan också vara möjligt att använda olika antikroppar och fisk sonder. När du väljer att använda olika antikroppar, är fluorokrom termostabiliteten och uttryck av målet antigenet på cellmembranet viktiga faktorer att tänka på. Intra-cytoplasmatic antigener kan också färgas. När använder olika fisk sonder, är det viktigt att kontrollera databladet specifikationerna för denaturering förfarandet och att förbereda celler för fisken assay med detta.
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |