Få høykvalitets genomisk DNA fra tumor vev er et viktig første skritt for å analysere genetiske endringer med neste generasjons sekvensering. I denne artikkelen presenterer vi en enkel og rask metode for å berike kreftceller og få intakt DNA fra touch forlaget cytologi prøver.
Det er viktig å bestemme mutational status i kreft før administrasjon og behandling av bestemte molekylær målrettet narkotika for kreftpasienter. I klinisk setting, er formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev mye brukt for genetisk testing. FFPE DNA er imidlertid vanligvis skadet og fragmentert under fiksering prosessen med formalin. FFPE DNA er derfor noen ganger ikke tilstrekkelig for genetisk testing på grunn av lav kvalitet og mengde DNA. Her presenterer vi en metode for preg forlaget cytologi (TIC) få genomisk DNA fra kreftceller, som kan observeres under et mikroskop. Cellen morfologi og kreft cellen tallene kan evalueres ved hjelp TIC prøver. Videre kan utvinning av genomisk DNA fra TIC prøver fullføres innen to dager. Den totale mengden og kvaliteten på TIC DNA Hentet ved hjelp av denne metoden var høyere enn FFPE DNA. Denne raske og enkle metoden tillater forskere å få høy kvalitet DNA for genetisk testing (f.eks, neste generasjons sekvensering analyse, digital PCR og kvantitative sanntid PCR) og forkorte tiden det rapporterer resultater.
Neste generasjons sekvensering teknologi har gitt forskerne betydelige fremskritt i å analysere genomet informasjon i genetisk variasjoner, Mendelian sykdom, arvelig predisposisjon og kreft 1,2,3 . Kreft genomet Atlas (TCGA) og International kreft genomet Consortium (ICGC) har forfulgt identifikasjon av genetiske endringer i flere typer vanlig kreft4. Hundrevis av viktige kreft driveren gener har blitt identifisert, og noen av disse molekylene er målrettet i narkotika utvikling1,5,6.
I klinisk setting brukes FFPE eksemplarer vanligvis for patologisk diagnose og molekylære testing for ulike sykdommer, inkludert kreft. Men under fiksering prosessen med formalin, DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking oppstår og DNA fragmentering er indusert. Dermed er FFPE DNA-prøver ikke alltid egnet for genetisk analyse på grunn av lav kvalitet og mengde DNA7,8,9. Dessuten tar det flere dager å forberede FFPE eksemplarer, og tekniske ferdigheter er nødvendig for å forberede nøyaktig delene. Derfor er det ønskelig å utvikle en enkel og rask metode for å få høy kvalitet intakt DNA.
Cytologi er en alternativ metode for patologisk diagnose. Fargemaskin eksempel forberedelse er en enklere, mindre kostbare og rask tilnærming sammenlignet med FFPE forberedelser10. TIC teknikken er utført på sentinel lymfeknuter og marginale vev fra brystkreftpasienter for intraoperativ rask diagnose for noen år11,12. Det er imidlertid noen rapporter som har undersøkt om høy kvalitet genomisk DNA kan hentes fra TIC prøver og brukes for påfølgende genetisk analyse. Fargemaskin prøver er vanligvis farget med Papanicolaou (Pap) eller Giemsa flekker, og vi har tidligere rapportert at mengden og kvaliteten av DNA utvunnet fra TIC prøver (spesielt Giemsa-farget eksempler) er overlegen prøver innhentet fra FFPE vev13. Sammenlignet med Pap flekker, har Giemsa flekker en fordel til krever mindre flekker prosedyrer. I Pap flekker, når prøvene er fast og farget, må de være montert med montering medium (f.eksMalinol) for å skille eksempel innholdet, for eksempel kreftceller og normale celler inflammatoriske celler under et mikroskop. Hvis Pap prøven er utarbeidet uten montering trinn, er det nesten umulig å observere cellene under et mikroskop fordi prøven er tørket. Til sammenligning Giemsa flekker kan observeres i tørket staten, derfor montering trinnet er ikke nødvendig for rask mobilnettet evaluering. For microdissection er Giemsa flekker mer egnet fordi det krever tørr prøver.
I denne rapporten, vi introdusere en enkel og rask metode for å forberede TIC prøver med Giemsa flekker og vise at TIC er en bedre kilde til DNA sammenlignet med FFPE eksemplarer.
I denne studien presenterte vi en alternativ metode for å få svulst DNA fra klinisk patologiske prøver med TIC. TIC forberedelse er svært enkel og trenger mindre tid sammenlignet med FFPE metoder, uten behovet for spesielle instrumenter10. Alle prosedyrer fra TIC forberedelse til DNA ekstraksjon kan fullføres innen to dager (figur 1). Denne metoden forkorter dermed tiden utføre genetisk testing. Spesielt, gir dette en betydelig fordel i forkortelsen antall dager…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle de medisinske og hjelpeutstyr ansatte på sykehuset og pasienter for samtykker i å delta. Vi takker Gabrielle White Wolf, PhD, fra Edanz gruppe (www.edanzediting.com/ac) for å redigere et utkast av denne rapporten. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for genom-forskningsprosjekt fra Yamanashi prefekturet (Y.H. og MO.) og stipend fra The YASUDA medisinske Foundation (Y.H.).
FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
Pincette | NATSUME | A-5 | |
1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |