Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi
Summary
Att få hög kvalitet genomiskt DNA från tumörvävnad är ett viktigt första steg för att analysera genetiska förändringar med nästa generations sekvensering. I denna artikel presenterar vi en enkel och snabb metod för att berika tumörceller och få intakta DNA från touch avtryck cytologi exemplar.
Abstract
Det är viktigt att fastställa mutationsstatus i cancer innan administration och behandling av specifika molekylära riktade läkemedel för cancerpatienter. I den kliniska inställningen används formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader allmänt för genetisk testning. FFPE DNA är dock generellt skadad och splittrad under processen fixering med formalin. Därför är FFPE DNA ibland inte tillräckligt för genetisk testning på grund av låg kvalitet och kvantitet av DNA. Här presenterar vi en metod för beröring avtryck cytologi (TIC) erhålla genomiskt DNA från cancerceller, som kan observeras under ett mikroskop. Cell morfologi och cancer cell nummer kan utvärderas med hjälp av TIC exemplar. Dessutom kan utvinning av genomisk DNA från TIC prover slutföras inom två dagar. Den totala mängden och kvaliteten på TIC DNA erhålls med denna metod var högre än för FFPE DNA. Denna snabba och enkla metod tillåter forskare att få hög kvalitet DNA för genetisk testning (t.ex., nästa generations sekvensering analys, digital PCR och kvantitativa realtid PCR) och att förkorta handläggningstiden för rapportering av resultat.
Introduction
Nästa generation sekvenseringsteknologi har gett forskare betydande framsteg i att analysera genominformationen i genetiska variationer, Mendelian sjukdomar, ärftliga anlag och cancer 1,2,3 . Den Cancer Genome Atlas (TCGA) och International Cancer Genome Consortium (ICGC) har drivit identifiering av genetiska förändringar i flera typer av vanliga cancerformer4. Hundratals viktiga bröstcancergener driver framgångsrikt har identifierats, och några av dessa molekyler är blir måltavla för drogen utveckling1,5,6.
I den kliniska inställningen används FFPE exemplar ofta för patologisk diagnos och molekylär testning för olika sjukdomar, inklusive cancer. Men under processen fixering med formalin DNA-protein eller DNA-DNA cross-linking uppstår och DNA-fragmentering induceras. Således, FFPE DNA-prover är inte alltid lämpliga för genetisk analys på grund av låg kvalitet och kvantitet av DNA7,8,9. Dessutom tar det flera dagar att förbereda FFPE exemplar och teknisk skicklighet är nödvändigt att noggrant förbereda avsnitten. Därför är det önskvärt att utveckla en enkel och snabb metod för att erhålla hög kvalitet intakt DNA.
Cytologi är en alternativ metod för patologisk diagnos. Cytologiska provberedning är en enklare, mindre dyra, och snabbare metod jämfört med FFPE förberedelse10. TIC tekniken har utförts på sentinel lymfkörtlar och marginella vävnader från bröstcancerpatienter för intraoperativ snabb diagnos för vissa år11,12. Det finns dock några rapporter som har undersökt om hög kvalitet genomiskt DNA kan extraheras från TIC exemplar och används för efterföljande genetisk analys. Cytologiska prover är vanligaste fläckade Papanicolaou (Pap) eller Giemsa färgning och tidigare rapporterade vi att mängden och kvaliteten av DNA extraheras från TIC exemplar (särskilt Giemsa-färgade prover) är överlägsna produktproverna FFPE vävnaderna13. Jämfört med Pap färgning, har Giemsa färgning en fördel i att kräva mindre färgning förfaranden. I Pap färgning, efter proverna har varit fixeras och färgas, måste de vara monterad med montering medium (t.ex., Malinol) för att skilja prov innehållet, till exempel tumörceller, normala celler och inflammatoriska celler i Mikroskop. Om Pap preparatet bereds utan det montering steget, är det nästan omöjligt att iaktta cellerna i Mikroskop eftersom preparatet torkas. I jämförelse, Giemsa färgning kan observeras i torkat tillstånd, därför montering steget är inte nödvändigt för snabb cellulära utvärdering. För lokalt är Giemsa färgning mer lämplig eftersom det kräver torra exemplar.
I detta betänkande, vi införa en enkel och snabb metod för att förbereda TIC exemplar med Giemsa färgning och visar att TIC är en bättre källa för DNA jämfört med FFPE exemplar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie presenterade vi en alternativ metod för att erhålla tumör DNA från kliniska patologiska prover med TIC. TIC förberedelserna är mycket enkel och kräver mindre tid jämfört med FFPE metoder, utan krav på särskilda instrument10. Alla procedurer från TIC förberedelse till DNA-extraktion kan slutföras inom två dagar (figur 1). Denna metod förkortar därmed handläggningstid för att utföra genetisk testning. Särskilt, ger detta en betydande …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla den medicinska personalen och servicepersonalen sjukhuset och patienterna för samtycker till att delta. Vi tackar Gabrielle White Wolf, PhD, från Edanz-gruppen (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta betänkande. Denna studie stöddes av ett bidrag för Genome Research Project från Yamanashi prefektur (Y.H. och M.O.) och ett bidrag från The YASUDA medicinska stiftelsen (Y.H.).
Materials
| FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| 16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
| Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
| petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
| SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
| Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
| Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| 1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |
Referências
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer – Three Strikes and You’re Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al. Rare variant discovery by deep whole-genome sequencing of 1,070 Japanese individuals. Nat Commun. 6 (8018), (2015).
- Vogelstein, B., et al. Cancer genome landscapes. Science. 339 (6127), 1546-1558 (2013).
- Zehir, A., et al. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 23 (6), 703-713 (2017).
- Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 53 (1), 17-37 (2013).
- Chalkley, R., Hunter, C. Histone-histone propinquity by aldehyde fixation of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (4), 1304-1308 (1975).
- Ben-Ezra, J., Johnson, D. A., Rossi, J., Cook, N., Wu, A. Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin-embedded material by the polymerase chain reaction. J Histochem Cytochem. 39 (3), 351-354 (1991).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am.J.Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Adhya, A. K., Mohanty, R. Utility of touch imprint cytology in the preoperative diagnosis of malignancy in low resource setting. Diagn Cytopathol. 45 (6), 507-512 (2017).
- Lumachi, F., Marino, F., Zanella, S., Chiara, G. B., Basso, S. M. Touch Imprint Cytology and Frozen-section Analysis for Intraoperative Evaluation of Sentinel Nodes in Early Breast Cancer. Anticancer Research. 32 (8), 3523-3526 (2012).
- Sumiyoshi, K., et al. Usefulness of intraoperative touch smear cytology in breast-conserving surgery. Exp Ther Med. 1 (4), 641-645 (2012).
- Amemiya, K., et al. Touch imprint cytology with massively parallel sequencing (TIC-seq): a simple and rapid method to snapshot genetic alterations in tumors. Cancer Med. 5 (12), 3426-3436 (2016).
- Goto, T., et al. Mutational analysis of multiple lung cancers: Discrimination between primary and metastatic lung cancers by genomic profile. Oncotarget. 8 (19), 31133-31143 (2017).
- Goto, T., et al. Detection of tumor-derived DNA dispersed in the airway improves the diagnostic accuracy of bronchoscopy for lung cancer. Oncotarget. 8 (45), 79404-79413 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Targeted and exome sequencing identified somatic mutations in hepatocellular carcinoma. Hepatol Res. 46 (11), 1145-1151 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Comparison between two amplicon-based sequencing panels of different scales in the detection of somatic mutations associated with gastric cancer. BMC Genomics. 17 (1), 833 (2016).
- Hirotsu, Y., et al. Intrinsic HER2 V777L mutation mediates resistance to trastuzumab in a breast cancer patient. Med Oncol. 34 (1), 3 (2017).
- Hirotsu, Y., et al. Detection of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese population using next-generation sequencing. Mol Genet Genomic Med. 3 (2), 121-129 (2015).
- Hirotsu, Y., et al. Multigene panel analysis identified germline mutations of DNA repair genes in breast and ovarian cancer. Mol Genet Genomic Med. 3 (5), 459-466 (2015).
- Lièvre, A., et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66 (8), 3992-3995 (2006).
- Mok, T. S., et al. Osimertinib or Platinum-Pemetrexed in EGFR T790M-Positive Lung Cancer. N Engl J Med. 376 (7), 629-640 (2017).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci rep. 13 (3), 3493 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 13 (7), 23 (2014).
