هذه المخطوطة يصف استخدام الصحفيين فلوروجينيك ترميز وراثيا في تطبيق التصوير خلية يعيش لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. ويوفر هذا النهج التجريبي القرار الزمانية المكانية لم يسبق لها مثيل، وحساسية، وخصوصية مع تجنب العديد من أوجه قصور الأساليب التقليدية المستخدمة للكشف عن الأكسدة السمية.
بينما الأكسدة إليه سمية يكثر ذكرها، الأساليب التقليدية للدراسة فإنه يعاني من عدد من أوجه القصور، بما في ذلك تدمير للعينة، والأخذ بالنتائج الملموسة المحتملة، وعدم وجود خصوصية لرد الفعل الأنواع المعنية. ومن ثم، هناك حاجة الحالية في مجال علم السموم للأساليب غير المدمرة وحساسة ومحددة التي يمكن استخدامها لمراقبة وقياس الاضطرابات الأكسدة داخل الخلايا، أكثر شيوعاً المشار إليها الأكسدة. وهنا نقدم طريقة لاستخدام اثنين من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا، roGFP2 وفرط، لاستخدامها في الدراسات خلية يعيش التصوير لمراقبة ردود الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. roGFP2 اكويليبراتيس مع الجلوتاثيون الأكسدة المحتملة (هالمدفع جريازيف)، بينما فرط مباشرة بالكشف عن فوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). يمكن التعبير عنها في مختلف أنواع الخلايا عن طريق تعداء أو توصيل كل من أجهزة الاستشعار، ويمكن أن تكون مستهدفة لمقصورات الهاتف الخلوي محددة. الأهم من ذلك، يوفر الفحص المجهري خلية يعيش باستخدام أجهزة الاستشعار هذه عالية الدقة المكانية والزمانية التي ليس من الممكن استخدام الأساليب التقليدية. التغيرات في كثافة fluorescence رصدها في 510 نانومتر يخدم كقراءات لكل فلوروجينيك ترميز وراثيا من أجهزة الاستشعار عند التتابع ولع 404 نانومتر و 488 نانومتر الضوء. هذه الخاصية تجعل كلا راتيوميتريك أجهزة الاستشعار، القضاء على الشائعة مجهرية التحف وتصحيح الاختلافات في التعبير الاستشعار بين الخلايا. ويمكن تطبيق هذه المنهجية عبر مجموعة متنوعة من منصات فلوروميتريك قادرة على انبعاثات مثيرة وجمع موجية المنصوص عليها، يجعلها مناسبة للاستخدام مع أنظمة التصوير [كنفوكل] والتقليدية واسع المجال المجهري، ولوحة القراء. استخدمت كل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، والدراسات السمية لمراقبة الهاتف الخلوي هالمدفع جريازيف والجيل2 2س ح في الوقت الحقيقي. المبين هنا هو أسلوب موحد قابل للتكيف على نطاق واسع عبر أنواع الخلايا ومنصات فلوروميتريك لتطبيق roGFP2 وفرط في خلية يعيش تقييمات السمية للأكسدة.
بعد مصطلح “الأكسدة” كثيرا ما يشار إليه في علم السموم، ونادراً ما هو هذا المصطلح هو موضح على وجه التحديد. الأكسدة ويمكن الرجوع إلى العديد من العمليات داخل الخلايا، بما في ذلك توليد الأنواع الأكسجين التفاعلية، والأضرار الناجمة عن الجذور الحرة، أكسدة الجزيئات المضادة للأكسدة، والشلالات حتى تفعيل إشارات محددة. وقد وثقت طائفة واسعة من الملوثات البيئية1،2 و3،وكلاء الدوائية4 لحفز الأكسدة أما العمل المباشر لمجمع إكسينوبيوتيك نفسها5 ،6 أو ثانوي بإنتاج أنواع الأكسدة كجزء من الاستجابة الخلوية7،،من89،10. ولذلك، من مصلحة كبيرة في علم السموم التقيد بدقة وتميز في عمليات الأكسدة مما يؤدي إلى نتائج سلبية. الأساليب التقليدية لقياس الأكسدة تنطوي على تحديد الجزيئات الحيوية المؤكسد11،،من1213،،من1415 أو المواد المضادة للأكسدة16 ،،من1718،،من1920، أو القياس المباشر للأنواع المتفاعلة أنفسهم21،،من2223، 24. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق عادة انقطاع الهاتف الخلوي، الذي كثيرا ما يستهلك العينة، ويلغي القرار المكانية ويحتمل أن يقدم التحف25. تطوير أساليب أكثر حساسية وتحديداً للكشف عن أنواع الأكسدة وعلامات للأكسدة قابل للتطبيق على نطاق واسع للتحقيق في الآثار السلبية للتعرض إكسينوبيوتيك.
خلية يعيش مجهرية باستخدام جيل جديد من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا برز كأداة قوية لرصد حالة الأكسدة داخل الخلية من الخلايا الحية. عادة ما يعبر عن هذه المجسات باستخدام ناقل تحت سيطرة أحد المروجين الفيروسية التي يتم تقديمها عن طريق منهجيات تعداء أو توصيل. التعبير عالية الكفاءة ليست ضرورية، نظراً للخلايا معربا عن استشعار الفلورسنت يمكن بسهولة تحديد بصريا. لتقييمات السمية، يمكن ملاحظة معربا عن أجهزة الاستشعار هذه الخلايا باستخدام مجهر الأسفار كما أنهم يتعرضون لمركبات إكسينوبيوتيك في الوقت الحقيقي. ويسمح هذا التصميم التجريبي القياسات المتكررة في نفس الخلية، مما يتيح الأساس أنشئت كل خلية بمثابة عنصر التحكم الخاص به. عالية الدقة الزمنية الممنوحة بتصوير خلية يعيش مناسبة تماما للكشف عن أحداث الأكسدة، خاصة تلك التي تعتبر متواضعة في حجمها أو عابرة في الطبيعة. بالإضافة إلى كونها حساسة ومحددة سواء لتلك الجزيئات المستهدفة، يمكن متحمس الأسفار بعض أجهزة الاستشعار هذه باستخدام اثنين من الأطوال الموجية للضوء. يسمح هذا الظاهرة انبعاث الفلورسنت يمكن التعبير عنها كنسبة، مما يسمح بتمييز التغييرات إشارة المرتبطة باستجابات استشعار أصيلة من تلك الناجمة عن المصنوعات اليدوية مثل الاختلافات في التعبير الاستشعار، وسمك الخلية، مصباح كثافة، فوتوبليتشينج، وحساسية الكاشف ومضان26. وهناك ميزة أخرى لاستخدام أجهزة الاستشعار فلوروجينيك هو أن أنها يمكن أن تكون مستهدفة لمقصورات الهاتف الخلوي محددة، إنشاء مستوى القرار المكانية التي لا مثيل لها بالطرق التقليدية25،،من2627.
وضعت عائلة كبيرة من أجهزة الاستشعار وراثيا ترميز استناداً إلى البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وتتميز بتقرير عن مجموعة متنوعة واسعة من العلامات الفيزيولوجية، بما في ذلك درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتركيزات الكالسيوم، ونسبة ATP/ADP25 ،،من2829،،من3031. وشملت من بين هذه مجسات الجلوتاثيون الأكسدة المحتملة (هالمدفع جريازيف) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). في حين وضعت أجهزة الاستشعار هذه التطبيقات في الأكسدة والاختزال علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاء، كانت أيضا تكييف لدراسة الأكسدة الناجمة عن إكسينوبيوتيك. على وجه التحديد، يصف البروتوكول الواردة هنا استخدام roGFP2 الاستشعار الإلكترونيةالمدفع جريازيف وأجهزة الاستشعار2 2س ح فرط.
roGFP2 تقارير بشأن إمكانيات الأكسدة داخل الخلايا الجلوتاثيون مخفضة والمؤكسدة (المدفع جريازيف/جسج) عن طريق تتابع الأكسدة والاختزال التي تنطوي على الجلوتاثيون البيروكسيديز (GPx) وجلوتاريدوكسين (جركس) ريدكتيز الجلوتاثيون (GR) (الشكل 1)25، 32 , 33-الجلوتاثيون هو جزيء المضادة للأكسدة الخلوية الغالبة وهي موجودة أساسا في شكل انخفاض (المدفع جريازيف) تركيزات ميليمولار في25،سيتوسول34. بينما هالمدفع جريازيف لا ترتبط أي نتائج وظيفية، من المسلم كمؤشر هام على حالة الأكسدة داخل الخلايا34. زيادة صغيرة نسبيا في تركيز جسج يؤدي إلى زيادة في هالمدفع جريازيف التي يمكن كشفها بواسطة roGFP2. المثل الهامة، رصد هالمدفع جريازيف استخدام roGFP2 خلال التعرض إكسينوبيوتيك يمكن أن يحتمل أن تكشف الكثير عن إليه العمل في عدة نقاط في التتابع الأكسدة وتحول المسارات المرتبطة بها، مثل فوسفات بنتوز (الرقم 1 )35. أجهزة الاستشعار الثاني مناقشتها هنا، فرط، داخل الخلايا ح2س2 تحقيقا المستمدة من إدخال البروتين نيون أصفر (يفب) في المجال التنظيمي البكتيرية ح2س2-النسخ الحساسة عامل OxyR136. على الرغم من أن سابقا اعتبر أكسجين تفاعلية مدمرة الوسيطة، ح2س2 تحظى باعتراف متزايد كجزيء إشارات داخل الخلايا هامة تحت الظروف الفسيولوجية37، 38، مما يوحي بوجود أدوار غير معروف لح2س2 في علم السموم، وكذلك. على سبيل المثال، يمكن أن يكون ح الزائدة2س2 الناجمة عن تعرض إكسينوبيوتيك تمهيدا للتقلبات في الإشارات الخلوية أو تحولاً في الاستقلاب.
وأعربت كل من أجهزة الاستشعار فلوروجينيك ترميز وراثيا في عدة خطوط الخلايا المحددة، بما في ذلك خط الخلية الكبدية شرانيه البشرية A431 وخط الخلايا الظهارية الشعب الهوائية البشرية بياس-2B، لمراقبة التغييرات في هالمدفع جريازيف وح2 س2 في الاستجابة لمجموعة متنوعة من التعرض للسمية. وتشمل هذه الملوثات الغازية (35من الأوزون)، ومكونات قابلة للذوبان من الجسيمات (1، 2 نفتوكينون39،40 والزنك41)، والنيكل جسيمات نانوية (بيانات غير منشورة). وتمثل هذه الدراسات فقط مجموعة فرعية صغيرة من التطبيقات الممكنة لهذه اثنين من أجهزة الاستشعار. من الناحية النظرية، يمكن أن تستخدم أي نوع من الخلايا غير قادرة على تلقي والإعراب عن الحمض النووي لأجهزة الاستشعار هذه من خلال تقنيات البيولوجيا الجزيئية التقليدية لتقييم آثار xenobiotics يشتبه في أن يغير حالة الأكسدة الخلوية. وحتى الآن، قد أعربت واحدة أو أكثر من هذه المجسات في مختلف بدائيات النوى وحقيقيات النوى، بما في ذلك عدة الثدييات والنباتات والبكتيريا والخميرة الخلية أنواع25،26،،من3642. قراءات لأجهزة الاستشعار2 2س هالمدفع جريازيف وح تغيير في كثافة fluorescence المنبعثة في 510 نيوتن متر عند الإثارة مع الضوء نانومتر 488 و 404. هذا الأسلوب القدرة على التكيف على نطاق واسع عبر منصات فلوروميتريك، بما في ذلك أنواع مختلفة من الفحص المجهري ([كنفوكل] وواسع المجال) ولوحة من القراء. يسمح الأسلوب الذي قدم إلى هنا للمراقبة حساسة ومحددة من داخل الخلايا هالمدفع جريازيف وح2س2 في نظم السمية في المختبر .
استخدام roGFP2 وفرط في الكشف عن التغييرات في داخل الخلايا هالمدفع جريازيف وح2س2، على التوالي، وقد وصفت جيدا في السابق الدراسات الفسيولوجية وسمية 25،35،36 ،،من3940،41،…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب يود أن يشكر Katelyn لافريتش للمساعدة في تصميم التجارب وعمليات تحرير المخطوطة.
roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |