Imaging tilgange til vurderinger af toksikologiske oxidativt Stress ved hjælp af genetisk kodet Fluorogenic sensorer
Summary
Dette manuskript beskriver brugen af genetisk kodet fluorogenic journalister i et program af live-celle imaging til gennemgang af xenobiotiske-induceret oxidativt stress. Denne eksperimentelle tilgang tilbyder uovertruffen spatiotemporelle opløsning, følsomhed og specificitet samtidig undgå mange af manglerne ved konventionelle metoder, der anvendes til påvisning af toksikologiske oxidativt stress.
Abstract
Mens oxidativ stress er et almindeligt citeret toksikologiske mekanisme, lider konventionelle metoder til at studere det af en række mangler, herunder ødelæggelse af prøven, indførelse af potentielle artefakter og manglende specificitet for den reaktive arter involveret. Der er således en aktuelle behov inden for toksikologi for ikke-destruktiv, følsomme og specifikke metoder, der kan bruges til at observere og kvantificere intracellulære redox perturbationer, mere almindeligt kaldet oxidativt stress. Her præsenterer vi en metode for anvendelse af to genetisk kodet fluorogenic sensorer, roGFP2 og HyPer, skal bruges i live-celle imaging studier til at observere xenobiotiske-induceret oxidative svar. roGFP2 afbalanceres med glutathion redox potentiale (EGSH), mens HyPer direkte registrerer hydrogenperoxid (H2O2). Begge sensorer kan udtrykkes i forskellige celletyper via Transfektion eller transduktion, og kan være målrettet mod specifikke cellulære rum. Vigtigst, tilbyder live-celle mikroskopi ved hjælp af disse sensorer høj rumlige og tidsmæssige opløsning, det ikke er muligt ved hjælp af konventionelle metoder. Ændringer i fluorescens-intensiteten overvåges på 510 nm tjener som udlæsning til både genetisk kodet fluorogenic sensorer når sekventielt ophidset af 404 nm og 488 nm lys. Denne egenskab gør begge sensorer ratiometric, at fjerne fælles mikroskopi artefakter og korrigere for forskelle i sensor udtryk mellem celler. Denne metode kan anvendes på tværs af en række fluorometriske platforme i stand til at spændende og indsamling emissioner på de foreskrevne bølgelængder, hvilket gør det velegnet til brug med Konfokal Billeddannende systemer, konventionelle wide-felt mikroskopi og plade læsere. Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer har været brugt i en række forskellige celletyper og toksikologiske undersøgelser for at overvåge cellulære EGSH og H2O2 generation i realtid. Skitseret her er en standardiseret metode, der er bredt kan tilpasses på tværs af celletyper og fluorometriske platforme for anvendelse af roGFP2 og HyPer i live-celle toksikologiske vurderinger af oxidativt stress.
Introduction
Udtrykket “oxidative stress” er ofte nævnt som en mekanisme i toksikologi, men er sjældent begrebet beskrevet specifikt. Oxidativ stress kan henvise til flere intracellulære processer, herunder generation af reaktive ilt arter, skader forårsaget af frie radikaler, oxidation af antioxidant molekyler, og endda aktivering af specifikke signalering kaskader. En bred vifte af miljøforurenende1,2 og apoteksagenter3,4 har dokumenteret for at fremkalde oxidativt stress ved enten direkte aktion af de xenobiotiske sammensatte, selv5 ,6 eller sekundært ved produktion af oxidant arter som en del af en cellulær svar7,8,9,10. Det er derfor af stor interesse for toksikologi til præcist at iagttage og karakterisere de oxidative processer, der fører til negative resultater. Konventionelle metoder til måling af oxidativt stress involverer identifikation af oxideret biomolekyler11,12,13,14,15 eller antioxidanter16 ,17,18,19,20, eller direkte måling af reaktive arter, selv21,22,23, 24. Disse metoder kræver dog typisk cellulære forstyrrelser, der ofte bruger eksemplet, rumlige opløsning, og potentielt introducerer artefakter25. Udviklingen af mere følsomme og specifikke metoder til påvisning af oxidant arter og markører af oxidativt stress er generelt gældende for undersøgelsen af de negative virkninger af xenobiotiske eksponering.
Live-celle mikroskopi ved hjælp af en ny generation af genetisk kodet fluorogenic sensorer er opstået som et kraftfuldt værktøj til at overvåge den intracellulære redox status af levende celler. Disse sensorer udtrykkes typisk ved hjælp af en vektor under kontrol af en viral promotor, der er indført via Transfektion eller transduktion metoder. Høj udtryk effektivitet er ikke nødvendige, da celler, der udtrykker den fluorescerende sensor kan let identificeres visuelt. Toksikologiske vurderinger, kan celler, der udtrykker disse sensorer observeres ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, som de udsættes for Miljøfremmede stoffer i realtid. Denne eksperimentelle design tillader gentagne målinger i samme celle, så hver celle etablerede baseline til at fungere som sin egen kontrol. Den høje tidsmæssige opløsning af live-celle imaging er velegnet til påvisning af oxidative begivenheder, især dem, der er beskedne i størrelsesorden eller forbigående karakter. Ud over at være følsomme og specifikke til deres målmolekyler, kan fluorescens af nogle af disse sensorer blive ophidset ved hjælp af to bølgelængder af lys. Dette fænomen giver den fluorescerende emission udtrykkes som en ratio, som tillader dømmekraft af signal ændringer forbundet med autentisk sensor svar fra dem, der forårsages af artefakter såsom variationer i sensor udtryk, celle tykkelse, lampe intensitet, photobleaching og følsomhed af fluorescens detektor26. En anden fordel ved brugen af fluorogenic sensorer er, at de kan være målrettet mod specifikke cellulære rum, at skabe et niveau af rumlige opløsning, der er uovertruffen ved konventionelle metoder25,26,27.
En stor familie af genetisk kodet sensorer baseret på grøn fluorescerende proteiner (NGL) er blevet udviklet og præget at rapportere om en lang række fysiologiske markører, herunder pH, temperatur, calcium koncentrationer og ATP/ADP-forholdet25 ,28,29,30,31. Blandt disse er sensorer af glutathion redox potentiale (EGSH) og hydrogenperoxid (H2O2). Mens disse sensorer blev udviklet til applikationer i redox biologi og fysiologi, er de også blevet tilpasset til at studere xenobiotiske-induceret oxidativt stress. Specifikt, beskriver den protokol, der er skitseret her brugen af EGSH sensor roGFP2 og H2O2 sensor HyPer.
roGFP2 rapporter om redox potentiale af intracellulære reduceret og oxideret glutathion (GSH/GSSG) gennem en redox relæ der involverer glutathion peroxidase (GPx), glutaredoxin (Grx) og glutathion reduktase (GR) (figur 1)25, 32 , 33. glutathion er fremherskende cellulær antioxidant molekyle og findes primært i sin reduceret form (GSH) i millimolar koncentrationer i cytosol25,34. Mens EGSH ikke har været knyttet til enhver funktionelle resultat, er det anerkendt som en vigtig indikator for intracellulære oxidative status34. En forholdsvis lille stigning i koncentrationen af GSSG resulterer i en stigning i EGSH , kan påvises ved roGFP2. Lige så vigtigt, overvågning af EGSH ved hjælp af roGFP2 under xenobiotiske engagementer kan potentielt afsløre meget om virkningsmekanisme på flere punkter i redox-relæ og tilknyttede veje, såsom pentose fosfat selvhelende (figur 1 )35. Den anden sensor diskuteret her, HyPer, er en intracellulær H2O2 sonde afledt af indføjelsen af gul fluorescerende proteiner (YFP) i den lovgivningsmæssige domæne af bakteriel H2O2-følsomme transskription faktor OxyR136. Selvom det har tidligere været betragtet som en ødelæggende reaktive oxygen mellemprodukter, er H2O2 i stigende grad ved at blive anerkendt som en vigtig intracellulære signalfunktion molekyle under fysiologiske tilstande37, 38, tyder på, at ukendte roller for H2O2 findes i toksikologi så godt. For eksempel, kunne overskydende H2O2 induceret af en xenobiotiske udsættelse være en forløber for dysregulering i cellulær signalering eller et skift i bioenergetik.
Begge genetisk kodet fluorogenic sensorer er kommet til udtryk i flere etablerede cellelinier, herunder menneskelige epidermoid karcinom cellelinie A431 og den menneskelige bronchiale epitelcelle linje BEAS-2B, at observere ændringer i EGSH og Hansen2 O2 som svar på en række forskellige toksikologiske engagementer. Disse omfatter forurenende luftarter (ozon35), opløselige komponenter partikler (1,2 naphthoquinone39,40 og zink41) og nikkel nanopartikler (ikke-offentliggjorte data). Disse undersøgelser udgør kun en lille delmængde af de mulige anvendelser af disse to sensorer. Teoretisk set, enhver celletype, der er i stand til at modtage og give udtryk for DNA af disse sensorer gennem konventionelle molekylærbiologiske teknikker kan udnyttes til at vurdere virkningerne af fremmedstoffer mistænkes for at ændre den cellulære oxidativt tilstand. Til dato, er en eller flere af disse sensorer udtrykt i forskellige prokaryoter og eukaryoter, herunder adskillige pattedyr, plante, bakteriel og gær celle typer25,26,36,42. Udlæsning til både EGSH og H2O2 sensorer er en ændring i intensiteten af fluorescens udledes på 510 nm ved excitation med 488 og 404 nm lys. Denne metode er meget tilpasningsdygtige på tværs af fluorometriske platforme, herunder forskellige former for Mikroskopi (Konfokal og wide-felt) og plade læsere. Metoden præsenteres her tillader til følsom og specifik overvågning af intracellulære EGSH og H2O2 i i vitro toksikologiske systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brug af roGFP2 og HyPer til at opdage ændringer i intracellulære EGSH og H2O2, henholdsvis, har været godt beskrevet i tidligere undersøgelser af fysiologiske og toksikologiske 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Den protokol, de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Katelyn Lavrich for assistance med eksperimentelle design og manuskript redigeringer.
Materials
| roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
| HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
| 9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
| Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
| BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
| Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
| NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
| Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |
Referências
- Cross, C. E., et al. Environmental oxidant pollutant effects on biologic systems: a focus on micronutrient antioxidant-oxidant interactions. Am J Respir Crit Care Med. 166, 44-50 (2002).
- Kobzik, L. Environmental particulate-mediated cytokine production in lung epithelial cells (A549): role of preexisting inflammation and oxidant stress. J Toxicol Environ Health. 55, 31-44 (1998).
- Jaeschke, H., McGill, M. R., Ramachandran, A. Oxidant stress, mitochondria, and cell death mechanisms in drug-induced liver injury: lessons learned from acetaminophen hepatotoxicity. Drug Metab Reviews. 44, 88-106 (2012).
- Wolf, M. B., Baynes, J. W. The anti-cancer drug, doxorubicin, causes oxidant stress-induced endothelial dysfunction. Biochim Biophys Acta. 1760, 267-271 (2006).
- Kumagai, Y., Shinkai, Y., Miura, T., Cho, A. K. The chemical biology of naphthoquinones and its environmental implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 52, 221-247 (2012).
- Pham, H. T., Maccarone, A. T., Campbell, J. L., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Ozone-induced dissociation of conjugated lipids reveals significant reaction rate enhancements and characteristic odd-electron product ions. J Am Soc Mass Spectrom. 24, 286-296 (2013).
- Abdel-Malek, Z. A., Kadekaro, A. L., Swope, V. B. Stepping up melanocytes to the challenge of UV exposure. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 171-186 (2010).
- Berisha, H., Pakbaz, H., Absood, A., Foda, H., Said, S. Nitric oxide mediates oxidant tissue injury caused by paraquat and xanthine oxidase. Ann N Y Acad Sci. 723, 422-425 (1994).
- Gao, X., et al. Mitochondrial dysfunction may explain the cardiomyopathy of chronic iron overload. Free Radic Bio Med. 49, 401-407 (2010).
- Shukla, A., et al. Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 285, 1018-1025 (2003).
- Charles, R., Jayawardhana, T., Eaton, P. Gel-based methods in redox proteomics. Biochim Biophys Acta. 1840, 830-837 (2014).
- Thornalley, P. J., Rabbani, N. Detection of oxidized and glycated proteins in clinical samples using mass spectrometry-a user’s perspective. Biochim Biophys Acta. 1840, 818-829 (2014).
- Arato, S., Ito, H., Miyashita, K., Hayakawa, K., Itabashi, Y. A facile method for the detection of aldehydes in oxidized lipids using solid-phase microextraction fiber and gas chromatograph equipped with a septum-free injector. J Oleo Sci. 58, 17-22 (2009).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840, 794-800 (2014).
- Churg, A., Keeling, B., Gilks, B., Porter, S., Olive, P. Rat mesothelial and tracheal epithelial cells show equal DNA sensitivity to hydrogen peroxide-induced oxidant injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 268, 832-838 (1995).
- Fraga, C. G., Oteiza, P. I., Galleano, M. In vitro measurements and interpretation of total antioxidant capacity. Biochim Biophys Acta. 1840, 931-934 (2014).
- Niki, E., Noguchi, N. Evaluation of antioxidant capacity: what capacity is being measured by which method. IUBMB Life. 50, 323-329 (2000).
- Pharikal, K., Das, P., Dey, C., Dasgupta, S. Tissue ascorbate as a metabolic marker in cadmium toxicity. Int J Vitam Nut Res. 58, 306-311 (1987).
- Tabata, M., Totani, M., Murachi, T. A chemiluminometric method for NADPH and NADH using a two-enzyme bioreactor and its application to the determination of magnesium in serum. Biomed Chrom. 4, 123-127 (1990).
- Ballatori, N., et al. Glutathione dysregulation and the etiology and progression of human diseases. Biol Chem. 390, 191-214 (2009).
- Nauseef, W. M. Detection of superoxide anion and hydrogen peroxide production by cellular NADPH oxidases. Biochim Biophys Acta. 1840, 757-767 (2014).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection and characterisation of radicals in biological materials using EPR methodology. Biochim Biophys Acta. 1840, 708-721 (2014).
- Kettle, A. J., et al. Measuring chlorine bleach in biology and medicine. Biochim Biophys Acta. 1840, 781-793 (2014).
- Carballal, S., Bartesaghi, S., Radi, R. Kinetic and mechanistic considerations to assess the biological fate of peroxynitrite. Biochim Biophys Acta. 1840, 768-780 (2014).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxid Redox Signal. 13, 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem. 279, 22284-22293 (2004).
- Malinouski, M., Zhou, Y., Belousov, V. V., Hatfield, D. L., Gladyshev, V. N. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PloS One. 6, 14564 (2011).
- Guzman, J. N., et al. Oxidant stress evoked by pacemaking in dopaminergic neurons is attenuated by DJ-1. Nature. 468, 696-700 (2010).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nat Med. 20, 555-560 (2014).
- Wolf, A. M., Nishimaki, K., Kamimura, N., Ohta, S. Real-time monitoring of oxidative stress in live mouse skin. J Invest Dermatol. 134, 1701-1709 (2014).
- Mishina, N. M., et al. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally. Antioxid Redox Signal. , (2011).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat Methods. 5, 553-559 (2008).
- Lohman, J. R., Remington, S. J. Development of a family of redox-sensitive green fluorescent protein indicators for use in relatively oxidizing subcellular environments. Biochem. 47, 8678-8688 (2008).
- Schafer, F. Q., Buettner, G. R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic Bio Med. 30, 1191-1212 (2001).
- Gibbs-Flournoy, E. A., Simmons, S. O., Bromberg, P. A., Dick, T. P., Samet, J. M. Monitoring intracellular redox changes in ozone-exposed airway epithelial cells. Environ Health Perspect. 121, 312 (2013).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods. 3, 281-286 (2006).
- Wood, Z. A., Poole, L. B., Karplus, P. A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 300, 650-653 (2003).
- Sies, H. Role of Metabolic H2O2 Generation REDOX SIGNALING AND OXIDATIVE STRESS. J Biol Chem. 289, 8735-8741 (2014).
- Cheng, W. -. Y., et al. Linking oxidative events to inflammatory and adaptive gene expression induced by exposure to an organic particulate matter component. Environ Health Perspect. 120, 267 (2012).
- Cheng, W. -. Y., et al. An integrated imaging approach to the study of oxidative stress generation by mitochondrial dysfunction in living cells. Environ Health Perspect. , 902-908 (2010).
- Wages, P. A., et al. Role of H 2 O 2 in the oxidative effects of zinc exposure in human airway epithelial cells. Redox Biol. 3, 47-55 (2014).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E GSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radic Bio Med. 51, 1943-1951 (2011).
- Schwarzländer, M., Dick, T. P., Meyer, A. J., Morgan, B. Dissecting redox biology using fluorescent protein sensors. Antiox Redox Signal. 24, 680-712 (2016).
- Wang, L., Atkinson, R., Arey, J. Formation of 9, 10-phenanthrenequinone by atmospheric gas-phase reactions of phenanthrene. Atmos Environ. 41, 2025-2035 (2007).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 1850, 2318-2328 (2015).
- Hou, J. -. T., et al. A highly selective water-soluble optical probe for endogenous peroxynitrite. Chem Commun. 50, 9947-9950 (2014).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Gabe, Y., Ueno, T., Urano, Y., Kojima, H., Nagano, T. Tunable design strategy for fluorescence probes based on 4-substituted BODIPY chromophore: improvement of highly sensitive fluorescence probe for nitric oxide. Anal Bioanal Chem. 386, 621-626 (2006).
- Garner, A. L., et al. Specific fluorogenic probes for ozone in biological and atmospheric samples. Nat Chem. 1, 316-321 (2009).
- Cheng, W. -. Y., Larson, J. M., Samet, J. M. Monitoring intracellular oxidative events using dynamic spectral unmixing microscopy. Methods. 66, 345-352 (2014).
- Wages, P. A., Cheng, W. -. Y., Gibbs-Flournoy, E., Samet, J. M. Live-cell imaging approaches for the investigation of xenobiotic-induced oxidant stress. Biochim Biophys Acta. 1860, 2802-2815 (2016).
