इस पांडुलिपि xenobiotic-प्रेरित oxidative तनाव की परीक्षा के लिए लाइव सेल इमेजिंग के एक आवेदन में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic पत्रकारों के उपयोग का वर्णन करता है । इस प्रायोगिक दृष्टिकोण अद्वितीय spatiotemporal संकल्प, संवेदनशीलता, और विशिष्टता प्रदान करता है, जबकि विषाक्तता oxidative तनाव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक तरीकों की कमियों के कई परहेज ।
जबकि oxidative तनाव एक सामांयतः उद्धृत विषाक्तता तंत्र है, पारंपरिक तरीकों का अध्ययन करने के लिए यह नमूना के विनाश, संभावित कलाकृतियों का परिचय सहित कमियों के एक नंबर से ग्रस्त है, और प्रतिक्रियाशील के लिए विशिष्टता की कमी प्रजातियों में शामिल हैं । इस प्रकार, वहां गैर के लिए विषविज्ञान के क्षेत्र में एक वर्तमान की जरूरत है विनाशकारी, संवेदनशील, और विशिष्ट तरीकों का पालन करने के लिए और intracellular redox perturbations यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक सामांयतः oxidative तनाव के रूप में जाना जाता है । यहां, हम दो आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर, roGFP2 और हाइपर के उपयोग के लिए एक विधि वर्तमान, जीने में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सेल इमेजिंग अध्ययन xenobiotic प्रेरित oxidative प्रतिक्रियाओं का पालन करें । glutathione redox क्षमता (EGSH) के साथ roGFP2 equilibrates, जबकि हाइपर सीधे हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2) का पता लगाता है । दोनों सेंसरों अभिकर्मक या transduction के माध्यम से विभिंन प्रकार के सेल में व्यक्त किया जा सकता है, और विशिष्ट सेलुलर डिब्बों को लक्षित किया जा सकता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, लाइव सेल माइक्रोस्कोपी इन सेंसर का उपयोग पारंपरिक तरीकों का उपयोग संभव नहीं है कि उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रदान करता है. प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन ५१० एनएम पर नजर रखी दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर के लिए readout के रूप में कार्य करता है जब क्रमिक रूप से उत्तेजित ४०४ एनएम और ४८८ एनएम प्रकाश द्वारा । यह गुण दोनों सेंसर ratiometric, आम सूक्ष्म कलाकृतियों को नष्ट करने और कोशिकाओं के बीच सेंसर अभिव्यक्ति में अंतर के लिए सही बनाता है. यह पद्धति fluorometric प्लेटफार्मों की एक किस्म रोमांचक और निर्धारित तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जन का संग्रह करने में सक्षम है, यह फोकल इमेजिंग सिस्टम, पारंपरिक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी, और प्लेट के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त बनाने में लागू किया जा सकता है पाठकों. दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर सेल प्रकार और विषाक्तता अध्ययन की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है सेलुलर ईGSH और वास्तविक समय में एच2ओ2 पीढ़ी की निगरानी । यहां उल्लिखित एक मानकीकृत विधि है कि व्यापक रूप से सेल प्रकार भर में अनुकूलनीय है और roGFP2 और हाइपर के आवेदन के लिए fluorometric प्लेटफार्मों रहते में oxidative तनाव के सेल विषाक्तता आकलन है ।
शब्द “oxidative तनाव” अक्सर विषविज्ञान में एक तंत्र के रूप में उद्धृत किया गया है, अभी शायद ही कभी यह शब्द विशेष रूप से वर्णित है । Oxidative तनाव कई intracellular प्रक्रियाओं को संदर्भित कर सकते हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी सहित, मुक्त कण की वजह से नुकसान, एंटीऑक्सीडेंट अणुओं के ऑक्सीकरण, और यहां तक कि विशिष्ट संकेत कैस्केडिंग के सक्रियण. पर्यावरणीय संदूषणों की एक व्यापक रेंज1,2 और दवा एजेंटों3,4 के लिए या तो xenobiotic यौगिक ही5 के प्रत्यक्ष कार्रवाई द्वारा oxidative तनाव प्रेरित प्रलेखित किया गया है ,6 या secondarily एक सेलुलर प्रतिक्रिया7,8,9,10के भाग के रूप में ऑक्सीडेंट प्रजातियों के उत्पादन से । यह विषविज्ञान में बहुत रुचि का है इसलिए सही निरीक्षण और oxidative प्रतिकूल परिणामों के लिए अग्रणी प्रक्रियाओं की विशेषता है । oxidative तनाव को मापने के पारंपरिक तरीकों में शामिल ऑक्सीकरण रोधी अणुओं की पहचान11,12,13,14,15 या antioxidants16 ,17,18,19,20, या प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में से प्रत्यक्ष माप स्वयं21,22,23, 24. हालांकि, इन तरीकों आमतौर पर सेलुलर व्यवधान, जो अक्सर नमूना खपत की आवश्यकता होती है, स्थानिक संकल्प समाप्त, और संभावित कलाकृतियों25परिचय । ऑक्सीडेंट प्रजातियों और oxidative तनाव के मार्कर का पता लगाने के लिए और अधिक संवेदनशील और विशिष्ट तरीकों का विकास मोटे तौर पर xenobiotic एक्सपोजर के प्रतिकूल प्रभावों की जांच के लिए लागू होता है ।
लाइव सेल माइक्रोस्कोपी आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर की एक नई पीढ़ी का उपयोग करने के लिए जीवित कोशिकाओं की intracellular redox स्थिति की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । इन सेंसरों आम तौर पर एक वायरल प्रमोटर कि अभिकर्मक या transduction के तरीके के माध्यम से पेश किया है के नियंत्रण में एक वेक्टर का उपयोग कर व्यक्त कर रहे हैं । उच्च अभिव्यक्ति क्षमता आवश्यक नहीं हैं, के बाद से फ्लोरोसेंट सेंसर एक्सप्रेस कोशिकाओं को आसानी से नेत्रहीन की पहचान की जा सकती है । विषाक्तता आकलन के लिए, इन सेंसरों व्यक्त कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में वे वास्तविक समय में xenobiotic यौगिकों को उजागर कर रहे हैं मनाया जा सकता है. इस प्रायोगिक डिजाइन एक ही सेल में दोहराया माप अनुमति देता है, प्रत्येक कोशिका की स्थापना की आधारभूत आधार पर अपने नियंत्रण के रूप में कार्य । उच्च लौकिक संकल्प जी द्वारा afforded-सेल इमेजिंग अच्छी तरह से oxidative घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुकूल है, विशेष रूप से उन है कि परिमाण या प्रकृति में क्षणिक में मामूली हैं । दोनों संवेदनशील और उनके लक्षित अणुओं के लिए विशिष्ट होने के अलावा, इन सेंसरों में से कुछ के प्रतिदीप्ति प्रकाश की दो तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर उत्साहित किया जा सकता है । यह घटना फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की अनुमति देता है एक अनुपात है, जो संकेत ऐसे सेंसर अभिव्यक्ति, सेल मोटाई, लैंप में बदलाव के रूप में कलाकृतियों के कारण उन से प्रामाणिक सेंसर प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े परिवर्तनों के प्रभेद परमिट के रूप में व्यक्त किया जा तीव्रता, photobleaching, और प्रतिदीप्ति डिटेक्टर की संवेदनशीलता26. fluorogenic सेंसर के उपयोग का एक और लाभ यह है कि वे विशिष्ट सेलुलर डिब्बों को लक्षित किया जा सकता है, स्थानिक संकल्प है कि पारंपरिक तरीकों25,26,27द्वारा बेजोड़ है के एक स्तर बनाने ।
आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) पर आधारित सेंसरों का एक बड़ा परिवार विकसित किया गया है और पीएच, तापमान, कैल्शियम सांद्रता सहित शारीरिक मार्करों की एक विस्तृत विविधता पर रिपोर्ट करने के लिए विशेषता है, और एटीपी/ADP अनुपात25 ,28,29,30,31. इन के बीच शामिल glutathione redox क्षमता (ईGSH) और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के सेंसर कर रहे हैं । इन सेंसरों redox जीव विज्ञान और फिजियोलॉजी में अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया था, वे भी xenobiotic प्रेरित oxidative तनाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है. विशेष रूप से, यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल ईGSH सेंसर roGFP2 और एच2ओ2 सेंसर हाइपर के उपयोग का वर्णन करता है ।
GSH GSSG (redox), glutathione (peroxidase), और GPx glutaredoxin (जीआर) (चित्रा 1)25, शामिल रिले के माध्यम से intracellular कम और ऑक्सीकरण glutathione (Grx/glutathione) की redox क्षमता पर roGFP2 रिपोर्ट ३२ , ३३. Glutathione प्रमुख सेलुलर एंटीऑक्सीडेंट अणु है और मुख्य रूप से cytosol25,३४में millimolar सांद्रता में अपनी कम फार्म (GSH) में मौजूद है । जबकि ईGSH किसी भी कार्यात्मक परिणाम से जोड़ा नहीं गया है, यह intracellular oxidative स्थिति३४के एक महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में पहचाना जाता है । ईGSH कि roGFP2 द्वारा detectable है में वृद्धि में GSSG परिणामों की एकाग्रता में एक अपेक्षाकृत छोटे वृद्धि हुई है । समान रूप से महत्वपूर्ण, ईGSH की निगरानी xenobiotic जोखिम के दौरान roGFP2 का उपयोग कर संभवतः बहुत redox रिले में कई बिंदुओं पर कार्रवाई के तंत्र के बारे में पता चलता है और जुड़े रास्ते, pentose फॉस्फेट अलग धकेलना के रूप में कर सकते है (चित्रा 1 )३५. दूसरा सेंसर यहां चर्चा की, हाइपर, एक intracellular एच2हे2 बैक्टीरियल एच2ओ के विनियामक डोमेन में पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के सम्मिलन से व्युत्पंन जांच-संवेदनशील प्रतिलेखन है भाज्या OxyR1३६. हालांकि यह पहले एक हानिकारक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती माना गया है, एच2ओ2 तेजी से एक महत्वपूर्ण intracellular के रूप में पहचाना जा रहा है शारीरिक स्थितियों३७के तहत अणु संकेतन, ३८, सुझाव है कि एच2ओ2 के लिए अपरिचित भूमिकाओं के रूप में अच्छी तरह से विषविज्ञान में मौजूद हैं । उदाहरण के लिए, अतिरिक्त एच2ओ2 एक xenobiotic जोखिम द्वारा प्रेरित सेलुलर संकेतन या में एक बदलाव dysregulation के लिए एक अग्रदूत साबित हो सकता है ।
दोनों आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorogenic सेंसर कई स्थापित सेल लाइनों में व्यक्त किया गया है, मानव epidermoid कार्सिनोमा सेल लाइन A431 और मानव के साथ-साथ उपकला कोशिका लाइन ब्यास-2 बी, ई में परिवर्तन का पालन करने के लिएGSH और एच२ ओ2 विषाक्तता जोखिम की एक किस्म के जवाब में । इनमें गैसीय प्रदूषक (ओजोन३५), पदार्थ कण के घुलनशील अवयव (1, 2 naphthoquinone३९,४० और जिंक४१), और निकेल नैनोकणों (अप्रकाशित डाटा) शामिल हैं । इन अध्ययनों से इन दो सेंसरों के संभावित अनुप्रयोगों का केवल एक छोटा सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं । सैद्धांतिक रूप से, किसी भी कोशिका प्रकार है कि प्राप्त करने में सक्षम है और पारंपरिक आणविक जीवविज्ञान तकनीक के माध्यम से इन सेंसर के डीएनए व्यक्त करने के लिए सेलुलर oxidative राज्य को बदलने के लिए संदिग्ध xenobiotics के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । तिथि करने के लिए, इन सेंसरों में से एक या अधिक कई स्तनधारी, संयंत्र, जीवाणु, और खमीर सेल प्रकार25,26,३६,४२सहित विभिंन prokaryotes और eukaryotes, में व्यक्त किया गया है । दोनों ईGSH और एच2ओ2 सेंसरों के लिए readout ४८८ और ४०४ एनएम प्रकाश के साथ उत्तेजना पर ५१० एनएम में उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की तीव्रता में एक परिवर्तन है । इस विधि व्यापक रूप से fluorometric प्लेटफार्मों भर में अनुकूलनीय है, माइक्रोस्कोपी के विभिंन प्रकार (फोकल और व्यापक क्षेत्र) और थाली पाठकों सहित । यहां प्रस्तुत विधि intracellular EGSH और H2O2 में इन विट्रो विषाक्तता प्रणालियों के संवेदनशील और विशिष्ट अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।
intracellular E में परिवर्तन का पता लगाने में roGFP2 और हाइपर का उपयोग करेंGSH और एच2ओ2, क्रमशः, पिछले शारीरिक और विषाक्तता अध्ययन में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है 25,३५,३६ <…
The authors have nothing to disclose.
लेखक प्रयोगात्मक डिजाइन और पांडुलिपि संपादन के साथ सहायता के लिए Katelyn Lavrich शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
roGFP2 Plasmid | University of Oregon | N/A | Generous gift of S.J. Remington |
HyPer Plasmid | Evrogen | FP941 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 10708984001 | |
9,10-Phenanthrenequinone | Sigma Aldrich | 156507 | |
Black Wall Glass Bottomed Dishes | Ted Pella | 14029-20 | |
BEAS-2B cell line | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
Keratinocyte Basal Medium | Lonza | 192151 | |
Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
Excel | Microsoft Office Suite | N/A | |
NIS-Elements AR Imaging Software | Nikon | N/A | |
Nikon C1si Confocal Imaging System | Nikon | N/A |