Approcci alla valutazione dello Stress ossidativo tossicologici utilizzando geneticamente codificato Fluorogenic sensori di imaging

Summary

Questo manoscritto descrive l’uso di reporters fluorogenic geneticamente codificati in un’applicazione di imaging di cellule vive per l’esame dello stress ossidativo indotto da xenobiotici. Questo approccio sperimentale offre ineguagliabile risoluzione spazio-temporale, sensibilità e specificità, evitando molte delle lacune dei metodi convenzionali utilizzati per la rilevazione dello sforzo ossidativo tossicologico.

Abstract

Mentre lo sforzo ossidativo è un meccanismo tossicologico comunemente citato, i metodi convenzionali di studiarlo soffrono di una serie di difetti, tra cui la distruzione del campione, introduzione di potenziali artefatti e una mancanza di specificità per il reattivo specie in questione. Così, c’è un bisogno attuale nel campo della tossicologia per i metodi non distruttivi, sensibili e specifici che può essere utilizzato per osservare e quantificare perturbazioni redox intracellulare, più comunemente indicati come stress ossidativo. Qui, presentiamo un metodo per l’utilizzo di due sensori fluorogenic geneticamente codificati, roGFP2 e HyPer, di essere usato negli studi di formazione immagine di cellule vive per osservare risposte ossidativa indotto da xenobiotici. roGFP2 equilibra con il potenziale redox del glutatione (_GSHdi E), mentre HyPer rileva direttamente il perossido di idrogeno (H₂O₂). Entrambi i sensori possono essere espressi in vari tipi cellulari tramite transfezione o trasduzione e possono essere mirati a specifici compartimenti cellulari. La cosa più importante, microscopia di vivere-cella utilizzando questi sensori offre alta risoluzione spaziale e temporale che non è possibile utilizzare i metodi convenzionali. Cambiamenti dell’intensità di fluorescenza monitorati a 510 nm serve come la lettura per entrambi i sensori fluorogenic geneticamente codificato quando eccitato in sequenza da 404 nm e 488 nm luce. Questa proprietà rende entrambi sensori raziometrici, eliminando gli elementi comuni di microscopia e la correzione per le differenze nell’espressione di sensore tra le celle. Questa metodologia può essere applicata attraverso una varietà di piattaforme fluorometriche capace di emozionante e raccolta delle emissioni alle lunghezze d’onda prescritte, che lo rende adatto per l’utilizzo con sistemi di imaging confocale microscopia convenzionale grandangolari e piastra lettori. Entrambi i sensori fluorogenic codificato geneticamente sono stati utilizzati in una varietà di tipi cellulari e studi tossicologici per monitorare cellulare E_GSH e H₂O₂ generazione in tempo reale. Qui delineato è un metodo standard che è ampiamente adattabile su tipi cellulari e fluorometriche piattaforme per l’applicazione di roGFP2 e HyPer nelle cellule vive valutazioni tossicologiche dello sforzo ossidativo.

Introduction

Il termine “stress ossidativo” è spesso citato come un meccanismo in tossicologia, eppure è raramente questo termine descritto in particolare. Lo stress ossidativo può riferirsi a diversi processi intracellulari, inclusa la generazione di specie reattive dell’ossigeno, danni causati dai radicali liberi, l’ossidazione di molecole antiossidanti, e anche l’attivazione di specifiche di segnalazione a cascata. Un’ampia gamma di contaminanti ambientali^1,2 e^3,di agenti farmaceutici⁴ sono stati documentati per indurre stress ossidativo sia agendo direttamente il composto xenobiotici in sé^{5 ,6} o secondariamente dalla produzione di specie ossidanti come parte di una risposta cellulare^7,8,9,10. È quindi di grande interesse in tossicologia accuratamente osservare e caratterizzare i processi ossidativi che portano a risultati negativi. I metodi convenzionali di misurazione dello stress ossidativo coinvolgono identificazione di biomolecole ossidato^{11,12,13,14,15} o antiossidanti^{16 ,17,18,19,20}, o la misura diretta delle specie reattive stessi^{21,22,23, 24}. Tuttavia, questi metodi richiedono in genere la rottura cellulare, che spesso consuma il campione, Elimina la risoluzione spaziale e potenzialmente introduce artefatti²⁵. Lo sviluppo di metodi più sensibili e specifici per la rilevazione di specie ossidanti e indicatori dello sforzo ossidativo è ampiamente applicabile per l’indagine degli effetti avversi dell’esposizione degli xenobiotici.

Microscopia di vivere-cella utilizzando una nuova generazione di sensori fluorogenic geneticamente codificato è emerso come un potente strumento per monitorare lo stato redox intracellulare delle cellule viventi. Questi sensori sono in genere espressi utilizzando un vettore sotto il controllo di un promotore virale che viene introdotto attraverso metodologie di transfezione o trasduzione. L’efficienza alta espressione non è necessario, poiché le cellule che esprimono il sensore fluorescente possono essere facilmente identificate visivamente. Per le valutazioni tossicologiche, le cellule che esprimono questi sensori possono essere osservate mediante microscopia a fluorescenza come sono esposti a composti xenobiotici in tempo reale. Questo disegno sperimentale consente misurazioni ripetute nella stessa cella, consentendo di riferimento di ogni cella di agire come il suo controllo. L’alta risoluzione temporale offerta da formazione immagine della vivere-cella è particolarmente adatta per la rilevazione di eventi ossidativi, specialmente quelli che sono modesti in grandezza o transitori in natura. Oltre ad essere sia sensibile e specifico per loro molecole bersaglio, la fluorescenza di alcuni di questi sensori possa essere eccitata utilizzando due lunghezze d’onda della luce. Questo fenomeno permette l’emissione fluorescente essere espresso come rapporto, che permette il discernimento dei cambiamenti del segnale associati a risposte sensore autentici da quelli causati da manufatti come variazioni di espressione di sensore, spessore della cella, lampada intensità, photobleaching e la sensibilità del rivelatore di fluorescenza²⁶. Un altro vantaggio dell’uso di sensori fluorogenic è che essi possono essere mirate a specifici compartimenti cellulari, creando un livello di risoluzione spaziale che è ineguagliata da metodi convenzionali^25,26,27.

Una grande famiglia di sensori geneticamente codificati basati sulla proteina fluorescente verde (GFP) sono stati sviluppati e caratterizzati al rapporto su un’ampia varietà di indicatori fisiologici, compreso il pH, la temperatura, le concentrazioni nel calcio e il rapporto ATP/ADP^{25 ,28,29,30,31}. Sono inclusi fra questi sensori del potenziale redox del glutatione (E_GSH) e perossido di idrogeno (H₂O₂). Mentre questi sensori sono stati sviluppati per applicazioni in redox biologia e fisiologia, sono stati anche adattati per studiare lo sforzo ossidativo indotto da xenobiotici. In particolare, il protocollo descritto qui descrive l’uso del roGFP2 di sensore E_GSH e il sensore di H₂O₂ HyPer.

roGFP2 segnala il potenziale redox del glutatione intracellulare ridotto e ossidato (GSH/GSSG) attraverso un relè redox che coinvolgono il glutatione perossidasi (GPx), glutaredossina (Grx) e glutatione reduttasi (GR) (Figura 1)^{25, 32 , 33}. il glutatione è la molecola antiossidante cellulare predominante ed è presente principalmente nella sua forma ridotta (GSH) in concentrazioni millimolar nel cytosol^25,34. Mentre E_GSH non è stato collegato a qualsiasi risultato funzionale, è riconosciuto come un importante indicatore di stato ossidativo intracellulare³⁴. Un relativamente piccolo aumento nella concentrazione di GSSG si traduce in un aumento in E_GSH che è rilevabile da roGFP2. Altrettanto importante, monitoraggio di E_GSH utilizzando roGFP2 durante le esposizioni xenobiotici può potenzialmente rivelare molto circa il meccanismo di azione in diversi punti nel relè redox e vie associate, quali il pentosio fosfato dello shunt (Figura 1 )³⁵. Il secondo sensore discusso qui, HyPer, è un’intracellulare sonda del₂ H₂O derivata dall’inserimento di proteina fluorescente gialla (YFP) nel dominio normativo batterica H₂O₂-trascrizione sensibili fattore OxyR1³⁶. Anche se si è precedentemente ritenuto una dannosa reattive dell’ossigeno intermedio, H₂O₂ è sempre più riconosciuto come un’importante molecola di segnalazione intracellulare sotto condizioni fisiologiche^{37, 38}, suggerendo che in tossicologia pure esistono ruoli non riconosciuti per H₂O₂ . Per esempio, in eccesso H₂O₂ indotti da esposizione a xenobiotici potrebbe essere un precursore di disregolazione nella segnalazione cellulare o uno spostamento in bioenergetica.

Entrambi i sensori fluorogenic geneticamente codificati sono state espresse in diverse linee cellulari stabilizzate, tra cui la linea cellulare di carcinoma epidermoide umano A431 e la linea di cellule epiteliali bronchiali umane BEAS-2B, per osservare i cambiamenti E_GSH e H₂ O₂ in risposta a una serie di esposizioni tossicologiche. Questi includono gli inquinanti gassosi (ozono³⁵), componenti solubili del particolato (1,2 naftochinone^39,40 e zinco⁴¹) e nanoparticelle di nichel (dati non pubblicati). Questi studi rappresentano solo un piccolo sottoinsieme delle possibili applicazioni di questi due sensori. Teoricamente, qualsiasi tipo di cellula che è in grado di ricevere ed esprimere il DNA di questi sensori attraverso tecniche di biologia molecolare convenzionali possa essere utilizzata per valutare gli effetti degli xenobiotici sospettate di alterare lo stato ossidativo cellulare. Ad oggi, uno o più di questi sensori è stato espresso in varie procarioti e negli eucarioti, tra cui diversi mammiferi, pianta, batterica e lievito cella tipi^25,26,36,42. La lettura per entrambi E_GSH e H₂O₂ sensori è un cambiamento nell’intensità di fluorescenza emessa a 510 nm eccitazione con 488 e 404 nm luce. Questo metodo è ampiamente adattabile fluorometrica tipi di piattaforme, tra cui vari tipi di microscopia (confocale e grandangolari) e i lettori di micropiastre. Il metodo qui presentato consente per osservazione sensibile e specifico di intracellulare E_GSH e H₂O₂ in sistemi in vitro tossicologici.

Protocol

1. preparazione delle celle Nota: Questa procedura descrive la trasduzione lentivirale di una linea di cellule immortalizzate (BEAS-2B; ATCC, Manassas, VA) per esprimere il reporter desiderato (roGFP2 o HyPer). Altre linee/tipi di cellule e/o metodi di trasferimento di geni, tra cui transfezione, possono essere utilizzati, purché si traducono in un livello di reporter espressione adeguata per visualizzare un numero sufficiente di cellule esprimenti sensore per campo visivo (in genere 5-10 celle…

Representative Results

L’uso di roGFP2 e HyPer nel rilevamento di modifiche EGSH e intracellulare H2O2 è stato ben descritto in precedenza25,36,42,43 ed è dimostrato qui. Immagini confocal di cellule che esprimono roGFP2 al basale e seguente aggiunta di H2O2 e DTT sono mostrati nella Figura 2. Dati …

Discussion

L’uso di roGFP2 e HyPer nel rilevare cambiamenti intracellulari E_GSH e H₂O₂, rispettivamente, è stata ben descritta in precedenti studi fisiologici e tossicologici ^{25,35,36 ,39,40,41,42,43}. Il protocollo descritto qui segn…

Materials

roGFP2 Plasmid	University of Oregon	N/A	Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid	Evrogen	FP941
Hydrogen Peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	10708984001
9,10-Phenanthrenequinone	Sigma Aldrich	156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes	Ted Pella	14029-20
BEAS-2B cell line	American Type Culture Collection	CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium	Lonza	192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit	Lonza	192060
Excel	Microsoft Office Suite	N/A
NIS-Elements AR Imaging Software	Nikon	N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System	Nikon	N/A