BLISS, een dubbele labeling protocol voor het bestuderen van de dynamiek van de lignification, werd ontwikkeld. Synthetische monolignol Klik verslaggevers en een sequentiële combinatie van SPAAC en CuAAC bioorthogonal met reacties, deze methodologie baant de weg naar diepgaande analyse van de factoren die de biogenese van Ligninen in plantaregelen.
Lignine is een van de meest voorkomende biopolymeren op de planeet en een belangrijk onderdeel van lignocellulose biomassa. Dit fenolische polymeer speelt een vitale structurele en beschermende rol in de ontwikkeling en de levensduur van hogere planten. Hoewel de ingewikkelde mechanismen tot regeling van lignification processen in vivo sterk de industriële valorisatie van vele plantgerelateerde producten beïnvloeden, heeft de wetenschappelijke gemeenschap nog steeds een lange weg te gaan om te ontcijferen hen. In een eenvoudige werkstroom van drie-stap kunnen de dubbele labeling protocol hier vermelde bioimaging studies van actief lignifying zones van plantaardige weefsels. De eerste stap bestaat in de metabole omzetting van twee onafhankelijke chemische verslaggevers, surrogaten van de twee inheemse monolignolen die aanleiding tot lignine H – en G-eenheden geven. Na opneming van de groeiende lignine polymeren, elke verslaggever vervolgens specifiek heet met eigen fluorescente sonde via een sequentiële combinatie van bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klik op reacties. In combinatie met lignine autofluorescence, deze aanpak leidt tot het genereren van kaarten van de drie kleuren lokalisatie van lignine binnen plantaardige celwanden door confocal fluorescentie microscopie en precieze ruimtelijke informatie over de aanwezigheid of afwezigheid van actieve lignification machines op de schaal van plantaardige weefsels, cellen en verschillende celwand lagen.
In de afgelopen twee decennia, heeft de chemische verslaggever strategie ontpopt als een krachtige in twee stappen methodologie voor het onderzoeken van de dynamiek en de functies van niet-genetisch gecodeerde biomoleculen. 1 , 2 , 3 in deze strategie een synthetische analogon van de Biomolecuul van belang met een kleine modulatie – de chemische verslaggever – eerste menselijk organisme worden gemetaboliseerd door het levend organisme, waarna een chemische sonde (bv., een fluorophore voor fluorescentie de weergave van de confocal microscopie) is covalent gekoppeld aan de opgenomen verslaggever via bioorthogonal Klik op chemie. De sonde moet reageren snel en in het bijzonder met de ingevoerde chemische modificatie terwijl het inerte aan elke biomoleculen in het leven-systeem aanwezig. In menig opzicht overwint deze methode de beperkingen van het gemeenschappelijk bioconjugation technieken door het gebruik van zeer specifieke Klik chemie ligations waardoor de mogelijkheid om spoor van metabolieten of biomacromoleculen die eerder niet toegankelijk waren in levende systemen4,5,6.
Ondanks de snel groeiende populariteit van deze krachtige methode in bacteriële en dierlijke cellen zijn rapporten beschrijven het gebruik ervan in plantenbiologie verrassend weinig en ver tussen7,8,9,10, 11,12. We waren vooral geïnteresseerd in de toepassing van deze strategie in de planten te bestuderen van de vorming van lignine, een van de meest voorkomende biopolymeren op de planeet en een belangrijk onderdeel van lignocellulose biomassa. 13 , 14 lignine is een fenolische polymeer dat een vitale structurele en beschermende rol in de ontwikkeling en de levensduur van hogere planten speelt.
Het is over het algemeen samengesteld uit drie 4-hydroxyphenylpropanoid wordt: H (p– hydroxyfenyl), G (guaiacyl) en S (syringyl) eenheden respectievelijk afgeleid van drie ‘monolignolen’ (p– coumaryl, coniferyl en sinapyl alcoholen) die zijn gesynthetiseerd via de Fenylpropanoïde-pathway in het cytoplasma van de cel (Figuur 1). Na wordt geëxporteerd naar de celwand, monolignolen worden geoxideerd aan radicalen door Peroxidasen of Laccasen waarna ze ondergaan puur chemisch radicaal-koppeling reacties op polymeriseren te lignine polymeren, een proces genoemd lignification. 15 , 16 hoewel Ligninen sterk beïnvloeden de industriële valorisatie van veel plantgerelateerde producten, de wetenschappelijke gemeenschap moet nog een lange weg te gaan om te ontcijferen van de ingewikkelde mechanismen tot regeling van de lignification.
Figuur 1: het lignification-proces in plantencellen. Monolignolen zijn levende van fenylalanine in het cytosol. Na wordt geëxporteerd naar de celwand, monolignolen worden geoxideerd aan radicalen door Peroxidasen of Laccasen waarna ze ondergaan puur chemisch radicaal-koppeling reacties op polymeriseren te lignine polymeren, een proces genoemd lignification. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Hoewel de verslagen over het gebruik van bioorthogonal reacties voor glycan analyse zijn talrijk,2,3,17 hun toepassingsvoorbeelden voor andere soorten biomoleculen zijn er minder. Het gebruik van bioorthogonal chemie lignine bioimaging oog werd pas onlangs gepionierd door Tobimatsu et al. 8 de Arabidopsis thaliana om informatie te verstrekken over de opneming van coniferyl alcohol surrogaten in het polymeer van de lignine waar vormt de G-eenheden,8,9 dus aantonen het bewijs van concept dat chemische verslaggever strategieën zijn van toepassing in deze context. Het gebruik van CuAAC werd ook geïllustreerd met behulp van een verschillende coniferyl alcohol afgeleide een paar maand later door Bukowski et al. 9 lignine bevat echter ook H en S eenheden en een dieper begrip van het lignification-proces vereist meer kennis over hoe alle van de monolignolen in het polymeer worden opgenomen en welke factoren kan het bepalen van de samenstelling. Nieuwe ontwikkelingen op dit gebied is momenteel afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte methoden voor het bijhouden van meerdere chemische verslaggevers gelijktijdig in levende systemen. Hoewel een paar artikelen over glycanen hebben de basis gelegd in de afgelopen jaren18,19,blijven20,21,22, dubbele etikettering benaderingen een belangrijke uitdaging in bioorthogonal chemie. Als een reproduceerbare single-labeling Klik protocol is moeilijk te ontwikkelen, dan dubbele labeling benaderingen waarvoor de optimalisatie in tandem van twee onderling zijn compatibel bioorthogonal reacties op twee afzonderlijke chemische verslaggevers nog moeilijker. De weinige voorbeelden die dit aspect een pionier gebruikt een combinatie van spanning-bevorderd azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en alkeen-tetrazine inverse elektronische vraag Diels-Alder (DAinv) reacties te bestuderen van glycanen in dierlijke cellen. Echter, we dachten dat de bioorthogonality van de DAinv reactie niet kan worden gegarandeerd in deze toepassing als gevolg van de structurele kenmerken van lignine (die bestaat uit een elektron-rijke gesubstitueerde cinnamyl-type monomeren die met elektron-armen reageren kunnen dienes zoals de tetrazine-sondes gebruikt in DAinv reacties) en dat dit aspecifieke labeling genereren kan. Bovendien, de DAinv reactie vereist chemische grepen die synthetisch moeilijk te toegang, maar ook als omvangrijk en lipofiele waardoor het verhogen van de mogelijkheid dat het tempo van de opname, het transport en/of de lokalisatie van de chemische stof verslaggever in vivo kan worden beïnvloed. Als wij van mening dat dit laatste aspect bijzonder relevant in het geval van een klik-chemie benadering voor het bestuderen van de lignification, we koos een andere richting en ontwikkeld met behulp van een Bioorthogonal afbinding Imaging sequentiële strategie (BLISS) een combinatie van Strain-Promoted Azide-alkyn cycloadditie (SPAAC) en koper gekatalyseerd Azide-alkyn cycloadditie (CuAAC) in vivo. 23
Deze twee reacties zijn inderdaad de twee belangrijkste bioorthogonal Klik op reacties die tot nu toe zijn gebruikt, en meer in het bijzonder de weinige voorbeelden van lignine imaging dat onlangs verschenen. 8 , 9 onze tweeledige labeling strategie maakt het gebruik van een azide groep op één monolignol verslaggever en een terminal alkyn anderzijds, twee chemische handvatten die i) onreactieve naar biologisch relevante structuren en ii) zeer klein is in omvang (Figuur 2 ). Dientengevolge, de gevolgen van deze synthetische wijzigingen op de fysisch-chemische eigenschappen van de Biomolecuul bestudeerde is geminimaliseerd waardoor de mogelijke verschillen tussen de substraten onnatuurlijk en natuurlijke monolignol op het gebied van vervoer en de tarieven van de metabolization tijdens de stap van de metabole omzetting. Hoewel de combinatie van SPAAC en CuAAC op het eerste gezicht zeer intuïtief lijkt, is het aan onze kennis alleen het tweede voorbeeld van dubbele markering met behulp van deze strategie en de eerste toepassing op structuren dan glycanen. 12 , 23
Figuur 2: BLISS dubbele strategie labeling. Chemische verslaggevers HAZ en GALK zijn tagged analogen van de inheemse H en G monolignolen. Ze worden voor het eerst opgenomen in de groeiende lignine polymeren van de celwanden door exogene voeding (stap 1). Cyclooctyne – en azide-matiemaatschappij fluorescerende sondes ligatuur dan achtereenvolgens aan de opgenomen verslaggevers door bioorthogonal verbonden zijn Klik op chemie: de reactie van de SPAAC (stap 2) is zeer specifiek van HAZ eenheden en wordt gevolgd door een CuAAC reactie ( stap 3) dat is specifiek van GALK eenheden (stap 3), waardoor de specifieke lokalisatie van beide verslaggevers onafhankelijk in hetzelfde monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Wij in de eerste plaats ontworpen de azide-gelabeld monolignol verslaggever HAZ (surrogaat van p– coumaryl alcohol) en voorloper van lignine H eenheden gevalideerd en vervolgens bedacht de BLISS tweeledige labeling strategie waarin het wordt gebruikt in combinatie met de eerder gemeld alkyn-gelabeld GALK,9 (surrogaat van coniferyl alcohol) en voorloper van lignine G eenheden. In dit reproduceerbare protocol ontwikkeld en getest in vlas, bereikte een economisch belangrijke plantensoorten, de dubbele metabole omzetting van HAZ pt GALK in lignine is eerst vóór sequentiële SPAAC/CuAAC labeling. Hier, worden tagged HAZ eenheden eerst specifiek aangeduid via de afbinding van de SPAAC van een cyclooctyne-matiemaatschappij fluorophore, gevolgd door CuAAC-gemedieerde Afbinding van een tweede fluorescente sonde op tagged GALK eenheden. Deze methode werd gebruikt voor het onderzoeken van de dynamiek van lignification processen binnen plantaardige celwanden en kan worden toegepast in vivo voort te vloeien dwarsdoorsneden, zowel de stengels als de zaailingen van verschillende plantensoorten leven.
Zoals eerder vermeld is de dubbele labeling BLISS-protocol gepresenteerd in dit document een van de eerste voorbeelden van een SPAAC/CuAAC combinatie in vivo12,23. Elke stap werd zorgvuldig geoptimaliseerd en gevalideerd, en het is zeer belangrijk dat de volgorde waarin de twee klik op chemie labeling reacties worden opeenvolgend uitgevoerd wordt nageleefd (dat wil zeggen, SPAAC eerste, gevolgd door CuAAC). Alle cross-controles is gebleken dat elke labeling stap specifieke wanneer het BLISS-protocol toegepaste23 is : eerste uitvoering van de SPAAC stap leidt tot de zeer chemoselective labeling van HAZ azide functies door de cyclooctyne-matiemaatschappij fluorophore door een reactie van de [3 + 2] cycloadditie met snelle kinetiek. Zodra HAZ eenheden zijn gecodeerd, kan de CuAAC stap copper(I) gekatalyseerd activering van GALK terminal alkynen te genereren van triazool links door reactie met de 545 azide-fluor-sonde vergend worden uitgevoerd. In contrast, de omgekeerde volgorde (dat wil zeggen, CuAAC eerste, gevolgd door SPAAC) mag niet worden gebruikt omdat het leidt tot GALK pt HAZ eenheid Kruis-koppeling, die concurreert met fluorophore afbinding en induceert een dramatisch verlies van signaal . Het is ook belangrijk om te benadrukken de noodzaak van de tussenliggende wassen stappen om te voorkomen dat niet-specifieke kleuring.
We hebben aangetoond dat onze methode kan worden toegepast op verschillende biologische experiment ontwerpen. De BLISS labeling protocol werd voor het eerst toegepast op freehand dwarsdoorsneden van vlas stengels (ongeveer 150-250 µm dik) die eerder werden gesneden en geïncubeerd met het klik-klaar monolignolen. Hoewel dit ontwerp het voordeel heeft van het minimaliseren van de benodigde hoeveelheid chemische verslaggever (zoals incubatie volumes worden verlaagd) en vergemakkelijking van de productie van statistische wordt gerepliceerd, is het niet, strikt genomen, een systeem in vivo en in sommige gevallen kunnen niet alle aspecten van echte spatio-temporele lignification dynamiek weerspiegelen. In een tweede proefopzet aangepast we daarom het BLISS-protocol, een methode die eerder werd gebruikt om te bestuderen van de opneming van radiolabeled monolignolen in pine en gingko27. In deze benadering, de wortels en de stam van de plant zijn fysiek van elkaar gescheiden en de basis van de hele stengel is uitgebroed in de oplossing van de monolignol in wat kan worden gesynchroniseerd met de aanpak van ‘bloemenvaas’. Na het verlaten van de stelen de gewenste (incubatietijd), zijn de dwarsdoorsneden knippen en het protocol van de BLISS uitgevoerd. Hierdoor konden wij tonen (i) dat de gewijzigde monolignolen worden getransporteerd via de levende stam en zijn opgenomen in het kweken van lignine polymeren binnen de celwanden en (ii) dat de lokalisatie patroon in wezen identiek is aan die van de dwarsdoorsnede was aanpak. Dit type experiment heeft de verdienste wordt uitgevoerd in een echte levende plant / levende cel aanpak waardoor langere experimenten en meer diepgaande studies, maar vereist grotere hoeveelheden chemische verslaggever. Ten slotte werd ook het BLISS-protocol gebruikt met vlas plant de zaailingen, vertegenwoordigen een echte levende plant model waarin de chemische verslaggevers geabsorbeerd door de wortels zijn moeten voordat het wordt vervoerd van de stengel. Terwijl dit model heeft het duidelijk voordeel wordt uitgevoerd in levende planten, in de praktijk is het beperkt tot jonge zaailingen en is niet echt geschikt is voor het onderzoeken van de dynamiek van de lignification in oudere planten om praktische redenen (lange incubatietijd, verhoogde hoeveelheid chemische verslaggevers). Echter deze drie experiment ontwerpen zijn complementair en hebben allemaal hun voor- en nadelen met betrekking tot de praktische aspecten en de biologische betekenis afhankelijk van het soort biologische vraag te worden beantwoord.
Ontwikkeld om te bestuderen van de dynamiek van de lignification in vlas, ons protocol is hoogst aanpasbaar, niet alleen in termen van biologische experiment design, maar ook op het gebied van de toepassing ervan op andere planten soorten en organen/weefsels. Bijvoorbeeld, kan BLISS gemakkelijk worden overgedragen aan de Arabidopsis of de Populus geslachten die meer vatbaar voor studies met knock-out of knock-down mutanten voor verschillende genen zijn. In principe, kunnen dual labeling studies met onze aanpak ook worden uitgebreid tot andere biomoleculen met behulp van twee afzonderlijke gewijzigde precursoren van plant celwand polymeren – met inbegrip van alle drie belangrijkste monolignolen of hun metabole precursoren en diverse monosacchariden die de polysacharide matrix vormen. Sinds haar oprichting, is bioorthogonal-chemie inderdaad voornamelijk ontwikkeld om onderzoeken van glycanen/polysacchariden door metabole oligosaccharide engineering (MOE)4,5,17,28, maar verrassend genoeg zijn er slechts zeer weinig applicaties te planten biologie tot nu toe7,8,9,10,11,12. In termen van verenigbaarheid van de reacties was de studie van lignine inderdaad een complexe zaak op te lossen als beide chemische verslaggevers zijn opgenomen in de dezelfde reticulated polymeer. De mogelijkheid voor labelloze HAZ–GALK kruislings gekoppelde formatie was het grote probleem te overwinnen als gevolg van de ruimtelijke nabijheid van GALK pt HAZ eenheden binnen de 3D structuur van lignine23, een beperking die mogelijk niet aanwezig als de twee chemische verslaggevers zijn niet opgenomen in de dezelfde soort biopolymeer of in dezelfde ruimtelijke regio van een bepaalde cel.
In een ruimer toepassingsgebied kan de BLISS-methodologie in wezen voor elke twee kleuren fluorescentie beeldvorming studie in bacteriële of dierlijke modellen met behulp van twee verschillende chemische verslaggevers, rekening houdend met een azide en terminal alkyn tag, respectievelijk worden toegepast.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dank verschuldigd aan de FRABio van de Federatie onderzoek en het TisBio imaging platform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblages Biomoléculaires) voor het verstrekken van de technische omgeving die bevorderlijk is voor het bereiken van dit werk.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |