Dette manuskript beskriver brugen af transgene reporter mus og forskellige administrationsveje af fluorescerende farvestoffer i angiotensin II-induceret hypertension ved hjælp af intravital video mikroskopi af blodkar til at evaluere aktivering af immunceller og deres evnen til at rulle og overholde endotelet.
Epifluorescensmikroskop intravital video mikroskopi (IVM) af blodkarrene er en etableret metode at evaluere aktivering af immunceller og deres evne til at rolle og overholde i endothelial laget. Visualisering af cirkulerende celler ved injektion af fluorescerende farvestoffer eller fluorophore-kombineret antistoffer er almindeligt anvendt. Alternativt, fluorescerende reporter mus kan bruges. Samspillet af leukocytter, i bestemt lysozym M+ (LysM+) monocytter, med karvæggen spille centrale roller i at fremme vaskulær dysfunktion og arteriel hypertension. Vi præsenterer her teknikken for at visualisere og kvantificere leukocyt rullende og vedhæftning i carotis arterierne i angiotensin II (AngII)-induceret hypertension hos mus af IVM.
Implantation af et kateter skader den vaskulære mur og fører til ændrede blodlegemer svar. Vi sammenlignede forskellige injektionsteknik og administrationsveje at visualisere leukocytter i en LysMCre+IRG+ mus med udbredt udtryk for rødt fluorescerende proteiner og betingede udtryk for grøn fluorescerende proteiner i LysM + celler. For at studere LysM+ celle aktivering, vi brugte AngII infunderes mus hvor rullende og vedhæftning af leukocytter til endotelet er steget. Vi injiceres enten acridin orange ved hjælp af en jugularis kateter eller direkte om halen vene og sammenlignet med mængden af rullende og vedhængende celler. Vi fandt, at jugularis kateter implantation i sig selv øget antallet af rullende og vedhængende LysM+ celler i sham-infunderes LysMCre+IRG+ mus i forhold til kontrol. Denne aktivering blev udvidet i AngII-infunderes mus. Interessant, indsprøjte acridin orange direkte gennem halen vene ikke øge LysM+ celle vedhæftning eller rullende i sham-infunderes mus. Vi viste dermed betydningen af transgene reporter mus udtrykker fluorescerende proteiner for at ikke forstyrre i vivo processer under eksperimenter. Derudover kan hale vene injektion af fluorescerende sporstoffer være et muligt alternativ til jugularis kateter injektioner.
Arteriel hypertension øger risikoen for hjerte-kar-sygdom og død og fremmer udviklingen af åreforkalkning, hjertekarsygdomme og arteriel eller venøs tromboembolier1. Udviklingen af hypertension afhænger af samspillet mellem miljømæssige, genetiske, endokrine og hæmodynamiske faktorer. I øjeblikket, er immunitet og relaterede inflammation værdsat for at spille en vigtig rolle i ætiologi af hypertension2.
Blandt immunceller, blev T-lymfocytter og monocytter og makrofager fundet for at være kausalt involveret i AngII-induceret vaskulære betændelse og hypertension, dels relateret til deres evne til at udløse reaktive ilt arter3. Makrofag koloni-stimulerende faktor mangelfuld mus viste reduceret svar til AngII vedrørende blodtryk stigning og vaskulære betændelse4. I et tidligere arbejde, kunne vi vise, at LysM + monocytter drive vaskulær dysfunktion og betændelse i AngII-induceret hypertension5. Vi beskrev mere for nylig, en roman pathway i hvilke koagulation faktor XI samarbejder med blodplader og karvæggen at fremkalde thrombin-afhængig vaskulære betændelse6. Den nuværende viden om rollen af immunsystemet i hypertension var for nylig opsummerede og gennemgået af Rodriguez-Iturbe mfl. 7
Da inddragelse af immunceller i udviklingen af hypertension fremgik, blev modeller og teknikker til at studere samspillet mellem skib og immunceller nødvendigt. Epifluorescence IVM af blodkar er et nyttigt værktøj til at observere i vivo samspillet mellem cirkulerende celler og endotelet8,9,10. Med denne teknik, kan indsprøjtning af farvestoffer intercalating med DNA (såsom acridin orange) visualisere nukleeret celler (cirkulerende samt fra endotelet). Isolerede blodplader farves ex vivo med rhodamin – 6 G eller dichlorofluorescein (DCF) kan sprøjtes for at visualisere trombocyt-rige Trombe i arteriel eller venøs skade modeller.
Typisk, en halsfedt kateter er brugt til at injicere røbestoffer eller markeret blodplader. Ændring af endotelet og efterfølgende aktivering af koagulationskaskaden er begge kendt for at have effekt på monocyt aktivering. Endotel skade fører umiddelbart til trombocyt aktivering via subendothelial matrix molekyler til at forsegle væv, med efterfølgende monocyt tiltrækning og aktivering11. Tværtimod er en intakt endotelet kendt for at have antikoagulerende egenskaber (f.eks. via væv faktor pathway hæmmer eller thrombomodulin)12 og direkte hæmmende effekt på monocyt, fxgennem udskillelsen af ekstracellulære vesikler indeholdende MicroRNA13. Monocytter er kendt for at producere en væv faktor, extrinsic aktivator af koagulationskaskaden og udtrykkelige protease-aktiverede receptorer (PARs) der kan være aktiveret af thrombin og deltage i monocyt aktivering14,15 . Derfor, enhver aktivering af trombocytter eller af koagulationskaskaden på grund af vaskulære skade kan have uventede virkninger på monocyt aktivering og forstyrre det observerede fænomen. Ved hjælp af IRG transgene LysM Cre Transgene mus, en dobbelt-fluorescerende Cre reporter mus (LysMCre+IRG+) foreslår vi at undersøge i detaljer effekten af injektioner med et kateter og alternative metoder på LysM+ myelomonocytic celler i en musemodel af arteriel hypertension16.
LysM+ monocytter blev tidligere vist sig at være impliceret i udviklingen af hypertension5. Her viser vi, LysM+ immunceller roll og overholde i endothelial laget i svar til AngII infusion. Dette resultat blev opnået ved hjælp af LysMCre+IRG+ mus fra vores tidligere undersøgelser at udforske rollen af immunceller i hypertension i vivo ved at visualisere leukocytter med injektion af acridin orange6,10. Forskelsbehandling af celletyper overholde endotelet var således ikke muligt.
IVM er et meget nyttigt værktøj for vaskulære studier og i vivo observationer af celler direkte i Vaskulaturen, men virkningen af indsprøjtning farvestoffer ved hjælp af en kirurgisk indsatte kateter i den inflammatoriske forbindelse med hypertension er fortsat ukendt. At vurdere den potentielle virkning af kateter og acridin orange injektion vi benyttede sig af LysMCre+IRG+ mus. AngII infusion steg antallet af rullende LysM+ celler til endotelet. Indsættelse af et kateter i halsfedt forstærkes effekten og mere rullende og vedhængende leukocytter blev opdaget i AngII-infunderes mus instrumenteret med et kateter i forhold til mus uden kateter implantater. Dette indikerer at implantation af en carotis kateter årsager en systemisk inflammatorisk reaktion i forbindelse med sårheling, overlejringer med immun reaktion ses i hypertension18. Hertil kommer, på grund af nærheden af halsfedt halspulsåren kan en yderligere immun aktivering være opstået ved at påvirke halsfedt. Da denne effekt ikke var til stede, når injektioner blev foretaget direkte i halen vene, kan vi antage, at effekten skyldtes ikke at farvestoffet, men at proceduren for indsættelse af kateteret. Vi viste her betydningen af transgene reporter mus udtrykker fluorescerende proteiner for at ikke forstyrre i vivo processer under eksperimenter. Derudover kan hale vene injektion af fluorescerende sporstoffer være et muligt alternativ til jugularis kateter injektioner.
Et kritisk trin i proceduren er AngII infusion. Hale manchet vurdering af blodtrykket kan foretages for at kontrollere effektiviteten af AngII levering af pumpen. Blodtrykket bør øge efter 2−3 dage infusion. For at begrænse inflammation, der kunne påvirke LysM+ celler aktivering, bør lukning af incisionen hvor pumpen er implanteret gøres med suturer i stedet for klip. Én begrænsning skal bemærkes om hale vene injektion: for at gøre den bedst mulige dataopsamling, 4 videoer normalt træffes for hver carotis. Hvis den fluorescerende signal falder, 50 µL acridin orange injiceres men med hale injection er det vanskeligere at gøre flere injektioner og holde carotiderne stabil under mikroskop mål. Varigheden af tilstedeværelsen af et kateter i halsfedt kan også modulere immunceller aktivering, da det påvirker koagulation aktivering i trombocyt-rich plasma fremstillet 4 h efter kateter implantation19. Dette aspekt af kateter implantation kræver yderligere undersøgelse.
Endelig, selv om vi sætter pris på virkningen af jugularis kateter implantation på LysM+ celle aktivering efter AngII infusion, ikke kan vi fuldt skønne forberedelse, hud fjernelse og carotis isolation på en potentiel LysM+ -celle rolle aktivering. Vi konkludere, at brugen af fluorescens reporter mus som LysMCre+IRG+ mus anbefales at undgå forstyrrelser af fartøjets integritet under den animalske forberedelse til i vivo billeddannelse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det tyske ministerium for uddannelse og forskning (BMBF 01EO1003 og BMBF 01EO1503).
Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
Braunol | B Braun | ||
Octeniderm | Schülke | ||
Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS – DualView2 MicroImager | |
Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |