Isolatie en karakterisatie van neutrofiele afkomstige deeltjes voor functionele Studies
Summary
Nieuwe protocollen worden hier beschreven om te isoleren en karakteriseren van deeltjes afgeleid van mens en muis neutrofiele granulocyten. Deze protocollen gebruiken ultracentrifugatie en stroom cytometry immunoblotting technieken voor het analyseren van microparticle inhoud, en ze kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de rol van deeltjes afgeleid van verschillende celtypes in cellulaire functie.
Abstract
Polymorfonucleaire neutrofiele afkomstige deeltjes (PMN)-MPs) zijn lipide dubbelgelaagde, sferische microvesicles met maten, variërend van 50 – 1.000 nm in diameter. Parlementsleden zijn een nieuwe ontwikkeling, belangrijk onderdeel van cel naar cel communicatie en signalering machines. Vanwege hun omvang en de aard van hun release, tot voor kort MP bestaan werd over het hoofd gezien. Echter, met verbeterde technologie en analytische methoden hun functie in gezondheid en ziekte is nu in opkomst. De hier gepresenteerde protocollen beogen te isoleren en karakteriseren van PMN-MPs door stroom cytometry en immunoblotting. Bovendien worden de verschillende uitvoering voorbeelden gegeven. Deze protocollen voor MP isolatie zijn snelle, goedkope en vereisen niet het gebruik van dure kits. Bovendien, zij maken voor de etikettering van MPs na het isoleren, evenals het vooraf labeling van broncellen voorafgaand aan MP release, met behulp van een membraan-specifieke fluorescente kleurstof voor visualisatie en analyse door stroom cytometry. Deze methoden hebben echter verschillende beperkingen, met inbegrip van de zuiverheid van PMNs en MPs en de behoefte aan geavanceerde analytische instrumentatie. Een high-end stroom cytometer is nodig om op een betrouwbare manier analyseren van MPs en valse positieve leest als gevolg van lawaai of auto-fluorescentie te minimaliseren. De beschreven protocollen kunnen worden gebruikt om te isoleren en definiëren van MP biogenese en karakteriseren van hun markeringen en variatie in samenstelling onder verschillende stimulerende omstandigheden. Grootte heterogeniteit kan worden benut om te onderzoeken of de inhoud van membraan deeltjes versus exosomes is anders, en of ze voldoen aan de verschillende rollen in weefsel homeostase. Tot slot de volgende isolatie en karakterisatie van MPs, hun functie in cellulaire reacties en verschillende modellen van de ziekte (met inbegrip van, PMN-geassocieerde inflammatoire aandoeningen, zoals inflammatoire darmziekten of Acute Lung Injury) kunnen worden onderzocht.
Introduction
Onlangs, “microdeeltjes/microvesicles” uit de cel cytosol of plasmamembraan geworden van wetenschappelijke belangstelling, zoals opkomende gegevens suggereren dat deze structuren, variërend van 50-1000 nm in diameter, biologische informatie kunnen dragen en dienen als een niet-canonieke manier van mobiele communicatie. Immuun cel-afgeleide MPs en met name degenen geproduceerd door polymorfonucleaire neutrofielen (PMNs) zijn van groot belang, gezien de belangrijke rol van PMNs in host defense1,2, inflammatoire reacties3en wond-genezing 4. intrigerend, tot dusver talrijke rapporten is gebleken zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire functies van PMN-MPs5, hetgeen wijst op een mogelijke kader-, ziekte-, soort- en orgel-specifieke rol van MPs.
Beschreven protocollen in deze mededeling bieden een kosteneffectieve, innovatieve en flexibele methode om te studeren van de functie van MPs in gezondheid en ziekte. Zij zijn van toepassing op vele modelorganismen, organen en stimulatie voorwaarden. Zij toestaan voor de identificatie van verschillende soorten MPs en in de toekomst inspelen op hun pro-inflammatoire en anti-inflammatoire functies kunnen worden gebruikt. Beschreven als voorbeeld, hier is hoe te het bestuderen van de functie van PMN-MPs in epitheliale wond genezing in vitro pt in vivo. Het gepresenteerde protocol voor isolatie van muis beenmerg-afgeleide PMNs is aangepast met enkele wijzigingen van een eerder beschreven methode6.
Bovendien protocollen die in deze studie worden beschreven voor de detectie en karakterisatie van specifieke markers die worden op PMN-MPs door twee complementaire methoden gevonden kunnen toestaan: Western blot en stroom cytometry. Wij vinden dat immunoblotting van MPs met standaardprotocollen5 is eenvoudig en betrouwbaar, echter, recente vooruitgang in de gevoeligheid van stroom cytometry instrumenten en betere ruis-signaalverhouding nu toestaan voor verdere analyse van MPs met behulp van deze methode. De beschreven protocollen in deze studie nemen recente vooruitgang en aanbevelingen van het oorspronkelijke onderzoek voorwerpen, met inbegrip van wijzigingen te centrifugeren snelheid en tijd, de toevoeging van monster filteren en bevriezing/opslag voorwaarden7 , 8, en hoe te verminderen de “achtergrondgeluid”, de detectiegrens van PMN-MPs te verbeteren, en onderscheid maken tussen verschillende maten van MPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protocollen voor de isolatie en de karakterisering van MPs PMN-afgeleid worden beschreven in deze mededeling. Verschillende belangrijke kritische punten moet worden in aanmerking genomen voor het succes van de procedure. PMNs moet eerst worden geïsoleerd vers en gebruikt in experimenten binnen 2 uur van isolatie om te voorkomen dat spontane activering en degranulatie. Alle behandeling van PMNs tijdens de isolatie en tot aan het punt van stimulatie moet worden uitgevoerd op het ijs om activering en voortijdige MP versie<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de technische bijstand van Dr. Suchitra Swaminathan die loopt van de noordwestelijke Feinberg School van geneeskunde Stroom Cytometry kern. Financiering werd verstrekt door (NIH) DK101675.
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
Referências
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
