Automatisert måling av Cryptococcal arter polysakkarid kapsel og celle kroppen
Summary
Denne teknikken beskriver en automatisert bakst image prosessor designet for å måle polysakkarid kapsel og kroppen radier. Mens opprinnelig utformet for Cryptococcus neoformans kapsel målinger automatisert bildeprosessoren kan også brukes til andre kontrast basert påvisning av sirkulære objekter.
Abstract
Formålet med denne teknikken er å gi en konsekvent, nøyaktig og håndterlig prosess for store tall av polysakkarid kapsel målinger.
Først er en terskel bildet generert basert på intensitetsverdiene unikt beregnes for hvert bilde. Deretter oppdages sirkler basert på kontrast mellom objekt og bakgrunnen med veletablerte sirkel Hough transformasjon (CHT) algoritmen. Endelig oppdaget celle kapsler og organer matches center koordinater og radius størrelse, og dataene eksporteres til brukeren i et håndterlig regneark.
Fordelene med denne teknikken er enkelt men betydelig. Først, fordi disse beregningene utføres av en algoritme i stedet for et menneske både nøyaktighet og pålitelighet er økt. Det er ingen nedgang i nøyaktighet eller pålitelighet uansett hvor mange eksempler er analysert. Andre etablerer denne tilnærmingen en potensiell standard prosedyre for feltet Cryptococcus i stedet for dagens situasjon der kapsel måling varierer av lab. Tredje, gitt at manuelle kapsel målinger er langsom og ensformig, automatisering kan rask målene på store mengder gjærceller som igjen muliggjør høy gjennomstrømning dataanalyse og stadig kraftigere statistikk.
De store begrensningene av denne teknikken kommer fra hvordan funksjonene algoritme. Først genererer algoritmen bare sirkler. Mens Cryptococcus celler og deres kapsler tar på en sirkulær morfologi, ville det være vanskelig å bruke denne teknikken til ikke-sirkulært objekt gjenkjenning. Andre, på grunn av hvordan sirkler oppdages CHT algoritmen kan oppdage enorme pseudo sirkler basert på ytre kant av flere gruppert sirkler. Men kan noen uriktig fremstilling cellen legemer fanget i pseudo sirkelen lett oppdaget og fjernet fra de resulterende datasettene.
Denne teknikken er ment for å måle sirkulær polysakkarid kapsler Cryptococcus arter basert på tusj lyse feltet mikroskopi; men det kan brukes til basert andre kontrast sirkulær objektet målinger.
Introduction
Cryptococcus neoformans er en sykdomsfremkallende gjær funnet overalt rundt om i verden som er tilknyttet for menneskelig sykdom i svekket immunapparat populasjoner. C. neoformans særlig utgjør en vesentlig årsak til totale årlige dødsfall i Sahara på grunn av infeksjonssykdommer1. Store klinisk manifestasjonen av cryptococcal infeksjon er meningoencefalitt, som følger invasjonen av sentralnervesystemet av transport i infiserte makrofager (trojansk hest måte) eller direkte krysset av blod – hjerne barrieren. C. neoformans uttrykker virulens-faktorer som inkluderer evnen å replikere på menneskekroppen temperatur, urease aktivitet, melanization og dannelsen av en polysakkarid kapsel2. Polysakkarid kapsel består av gjentatte glucuronoxylomannan og glucoronoxylomannangalactan polymerer og funksjoner som en beskyttende barriere mot kjønnsbasert miljøbelastning og vert immunreaksjoner2.
Selv om størrelsen på cryptococcal polysakkarid kapsel størrelsen ikke konsekvent er knyttet til virulens, er det bevis for at det er en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Kapsel størrelse er forbundet med meningitt patologi6, kan påvirke macrophage muligheten til å kontrollere Cryptococcus infeksjon5og kan resultere i tap av virulens hvis fraværende8. Derfor kapsel størrelse mål er vanlig i cryptococcal forskning, men det er ingen fieldwide standard for en metode for kapsel måling.
Foreløpig C. neoformans polysakkarid kapsel måling er basert på manuelle målinger av mikroskopi bilder og eksakt metodene av både bilde og mål oppkjøp variere laboratorier9,10, 11. En umiddelbar bekymring til denne metoden er at noen studier krever oppkjøpet av enkeltmål, som gjør opprettholde nøyaktigheten og påliteligheten vanskelig. Videre selv når resultatene er publisert, er det ofte utilstrekkelig beskrivelse av metoden måling. Mange publikasjoner ikke forklare hvordan deres mål ble oppnådd, hva fokalplanet ble brukt, hvordan de bestemmes terskelen for kapsel identifikasjon, om de brukte radius eller diameter, enten de brukes ett mål eller gjennomsnitt flere eller andre detaljer. Noen publikasjoner eneste staten sin metode som hvilket program som ble brukt, f.eks “Adobe Photoshop CS3 ble brukt til å måle cellene”11. Denne mangelen på standardisering og rapportering detaljer kan gjøre reproduserbarhet vanskelig om ikke umulig. Forskjeller i menneskelige syn, datamaskin lysstyrke, mikroskop innstillinger, skyv belysning og andre faktorer kan variere ikke bare mellom individer, men mellom prøvene, mens beregninger basert på prosenter av bildepunktverdier intensitet forblir konstant og gjeldende mellom eksempler. Denne teknikken ble generert i sammenheng med gir en standardisert, nøyaktig, rask og enkel metode for å måle kapsler størrelser for et felt der var det ingen før.
Som tidligere nevnt, CHT algoritmen er veletablert og skript automatisk merker sirkler har blitt skrevet før. Denne metoden øker i to områder der andre skript ville bommer. Først bare oppdage sirkler er ikke nok, fordi to forskjellige sirkler må registreres med cryptococcal celler, i forhold til hverandre. Denne metoden spesielt oppdager cellen legemer i kapsler, diskriminerer mellom to, og utfører beregninger på relevante kroppen-kapsel parene. Andre, selv når etter den samme protokoll, ulike etterforskere vil ende opp med forskjellige kjøpt bilder. Ved at etterforsker kontroll over enhver algoritmen parameter, kan dette verktøyet justeres for å matche en rekke anskaffelsesmetoder. Det er ikke behov for en standardisert omfang, mål, filtrere og så videre.
Denne teknikken kan lett brukes på enhver situasjon som etterforskeren må merker sirkler i et bilde som kontrast med sin bakgrunn. Begge sirkler lysere og mørkere enn deres bakgrunn kan registreres, telles og målt ved hjelp av denne teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De avgjørende skritt i denne teknikken er forbereder tusj lysbildet og anskaffe mikroskop-bildene. Mens algoritmen har blitt testet med en rekke lysbilde og bildet er det anbefalte protokollen beskrevet i dette manuskriptet. Polysakkarid kapsel oppdages basert på utelukkelse av blekk partikler fra domenet av kapselen som disse partiklene er for store til å trenge polysakkarid fibril nettverket. Tusj utelukkelse resulterer i en lyse sirkel på en mørk bakgrunn. Algoritmen merker sirkler basert på hvor godt de kontras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å erkjenne Anthony Bowen lysbilder som ble brukt som en andre menneskelige side-ved-side-sammenligning samt Sabrina Nolan lysbilder som ble brukt som en tredje menneskelige side-ved-side og andre mikroskop sammenligning.
Materials
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22×22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. d. e. S., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
