برنامج متكامل لرسم خرائط الجينوم على نطاق الدول الكروماتين استخدام رقاقة الفائق-التسلسل في أنسجة الورم
Summary
هنا، نحن تصف الفائق محسن رقاقة-تسلسل البروتوكول وأنابيب التحليلات الحسابية لتحديد أنماط الدولة الكروماتين على نطاق الجينوم من أنسجة الورم المجمدة وخطوط الخلية.
Abstract
التعديلات هيستون تشكل عنصرا رئيسيا ابيجينومي ولعب أدوار تنظيمية هامة في تحديد حالة النسخي المكاني المرتبطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت وجود تعديلات محددة لتحديد موقع وهوية غير ترميز العناصر الفنية مثل القدرة على. في السنوات الأخيرة، أصبحت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً تسلسل الجيل القادم (الرقائق-seq) أداة قوية في تحديد الملامح على نطاق الجينوم التعديلات هيستون الفردية. ومع ذلك، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن أنماط اندماجي لتعديلات الكروماتين، يشار إلى الدول الكروماتين، تحديد هوية وطبيعة محور الجينوم المرتبطة بها. ولذلك، مهام سير العمل تتألف من المنهجيات (HT) الفائق قوية للتنميط عددا من هستون تعديل علامات، فضلا عن التحليلات الحسابية أنابيب قادرة على التعامل مع إعداد كبيرة من شرائح Seq التنميط مجموعات البيانات، هناك حاجة تصميم شامل من الدول ابيجينوميك في عدد كبير من العينات. سير العمل تقنية HT-رقاقة-Seq المعروضة هنا تتكون من وحدتين: 1) على بروتوكول تجريبي للتنميط عدة تعديلات هستون من كميات صغيرة من عينات الورم وخطوط الخلايا في صيغة 96-جيدا؛ و 2) خط أنابيب تحليل بيانات حسابية التي تجمع بين الأدوات الموجودة لحساب الأشغال مارك الفردية وأنماط الدولة الكروماتين اندماجي. معا، تيسير هذه الوحدات اثنين من السهل معالجة مئات من عينات Seq رقاقة بطريقة سريعة وفعالة. يتم استخدام سير العمل المقدمة هنا لاستخلاص أنماط الكروماتين الدولة من هستون 6 مارك الملامح في أورام سرطان الجلد، وخطوط الخلايا. عموما، فإننا نعرض سير عمل رقاقة seq شاملة التي يمكن تطبيقها على العشرات من عينات الورم البشري وسرطان الخلية خطوط لتحديد الانحرافات ابيجينوميك في مختلف الأورام الخبيثة.
Introduction
معظم الثدييات الجينوم (98-99 في المائة) وتتألف من تسلسل فضله، وهذه المناطق نوكودينج تحتوي على العناصر التنظيمية المعروفة للمشاركة في التحكم في التعبير الجيني والكروماتين المنظمة1،2. في خلية عادية، الجمعية العامة المحددة من الحمض النووي في هيكل الكروماتين المضغوطة الحاسمة للمنظمة المكانية والتنظيم والتوقيت الدقيق لمختلف العمليات المرتبطة بالحمض النووي3،،من45. في خلية سرطان بيد الكروماتين تعديلات من قبل آليات جينية شاذة يمكن أن يؤدي إلى سوء تنظيم هيكل الكروماتين، بما في ذلك الوصول إلى العناصر التنظيمية، ونظم حلقات الكروموسومات والجينات أنماط التعبير6، 7،،من89،10.
وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، لدينا محدودة الفهم لتعديلات جينية المرتبطة بتطور الورم أو الاستجابة العلاجية. Epigenome يتكون من مجموعة تعديلات، بما في ذلك علامات هيستون ومثلايشن الحمض النووي، التي تشكل مجتمعة دولة ديناميكية (المشار إليها كدولة الكروماتين) التي تؤثر على شبكات التعبير الجيني وغيرها من العمليات الهامة للمحافظة على الهوية الخلوية. في الآونة الأخيرة، وقد تبين التعديلات في القدرة على في الأورام الخبيثة متعددة بدراسة ملامح H3K27Ac11. على الرغم من أن مثل هذه الدراسات توفر نظرة ثاقبة الترابط بين علامات جينية معزولة، أكثر من 100 إجراء تعديلات جينية قد حددت12،13 دون فهم واضح لدورها البيولوجي و الترابط. وعلاوة على ذلك، هناك عدد أكبر من أنماط اندماجي ممكن هذه هيستون وتعديلات الحمض النووي، ومن هذه الأنماط اندماجي-التعديلات الفردية لا-أن تملي الولايات جينية14. ومن ثم، هناك حاجة هائلة لتحديد التعديلات في هذه الدول الكروماتين أثناء تطور السرطان أو الردود على العلاج. معرفة شاملة بالتعديلات ابيجينومي في حالات السرطان قد تم متخلفة جزئيا بسبب التقنية (مثل توليد البيانات على نطاق واسع من كمية صغيرة من الخلايا مفرد المواد السريرية) وتحليلية (مثل خوارزميات لتحديد التحديات التي تواجه الدول اندماجي). ولذلك، هناك حاجة ماسة لأساليب الفائق قوية للتنميط عدد كبير من هستون تعديل علامات من المواد السريرية وسهلة لتنفيذ النهج الحسابية للتنبؤ بأنماط التوافقي الذي سيسهل تصميم جينية الدول المرتبطة بمراحل مختلفة من توموريجينيسيس والمقاومة العلاجية. علاوة على ذلك، البيانات المتاحة من الأخيرة epigenome التنميط الدراسات15،16،17،،من1819،20،21، 22،23 في الأنسجة العادية وخطوط الخلايا يمكن أن تكون متكاملة مع التشكيلات الكروماتين للأورام لمزيد ثاقبة epigenome مساهمة البيولوجيا الورم.
الكروماتين التنميط أصبح أداة قوية لتحديد أنماط الربط العالمي الكروماتين مختلف التعديلات15،24. وفي السنوات الأخيرة، أصبحت رقاقة seq “المعيار الذهبي” لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي من البروتين على نطاق عالمي26،25،27. لأي تجربة رقاقة seq، هناك الخطوات الحاسمة اللازمة لنجاحها، بما في ذلك تجهيز الأنسجة وعدم اقتران، وتحديد شروط sonication الأمثل، تحديد تركيز الضد الأمثل لهطول الأمطار، إعداد مكتبة، التسلسل بعد تجهيز البيانات، وتحليل المتلقين للمعلومات. كل خطوة من هذه الخطوات تتضمن نقاط التفتيش الرئيسية في مجال مراقبة الجودة، وعندما تؤخذ معا، تعتبر حاسمة لتحديد الأهداف المحتملة للتحقق من الصحة الوظيفية بشكل صحيح. من خلال الابتكار في هذه الخطوات، العديد من الدراسات السابقة قد وضع منهجيات لأداء رقاقة أو Seq تشيب من كمية صغيرة من الأنسجة28،،من2930،31،32 . علاوة على ذلك، اقترحت بعض الدراسات القائمة على بروتوكولات لإجراء التجارب على رقاقة الفائق تليها بكر كوانتيتيشن33،34. وأخيراً، بعض مناهج التحليل المتاحة علانية Seq رقاقة البيانات متاحة الآن مثل عزق35 و36من المجرة. ومع ذلك، تفتقر إلى برنامج متكامل لأداء رقاقة Seq في طريقة الفائق في تركيبة مع خط أنابيب حسابية لأداء مارك واحد، فضلا عن تحليلات الدولة الكروماتين.
هذا البروتوكول يصف سير seq شريحة كاملة وشاملة لرسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة للدول الكروماتين في أنسجة الورم وخطوط الخلية، مع سهولة اتباع المبادئ التوجيهية ليشمل جميع الخطوات اللازمة لتجربة ناجحة. باعتماد أسلوب الفائق الموصوفة سابقا من جونين Blecher et al. 37، هذا البروتوكول يمكن أن يؤديها على عشرات من العينات في نفس الوقت وقد طبق بنجاح في خطوط خلايا السرطان والأورام البشرية مثل سرطان الجلد والقولون والبروستاتا وجليوبلاستوما عديدة الأشكال. علينا أن نظهر منهجية التعديلات هيستون الأساسية الستة التي تمثل المكونات الرئيسية في الساحة التنظيمية جينية في خطوط الخلايا البشرية سرطان الجلد وعينات الورم. وتشمل هذه التعديلات H3K27ac (محسنات)، H3K4me1 (القدرة على نشاط ويستعد)، H3K4me3 (مروجي)، H3K79me2 (نسخها من المناطق)، H3K27me3 (بوليكومب القمع)، و H3K9me3 (heterochromatic القمع). يمكن استخدام هذه العلامات أما وحدها أو في تركيبة لتحديد الدول الكروماتين وظيفيا متميزة تمثل المجالات القمعية والنشطة على السواء.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول وحدة كاملة وشاملة من جانب seq رقاقة الفائق لرسم خرائط الجينوم على نطاق المنظومة للدول الكروماتين في خطوط الخلايا والأنسجة البشرية الورم. في أي بروتوكول seq رقاقة، واحد من أهم الخطوات خصوصية جسم. وهنا، يوضح هذا الأسلوب الظروف إيمونوبريسيبيتيشن للتعديلات هيستون وصف ستة، ك…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ماركوس كويل، غمبس كورتيس، الأساسية SMF في مداكك لدعم التسلسل. العمل الموصوف في هذه المقالة دعم المنح من المنحة المعاهد الوطنية للصحة (CA016672) “نواة صندوق التدابير الخاصة” وجوائز لجنة التحقيق الوطنية (1K99CA160578 و R00CA160578) ر. ك.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
Referências
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
- Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
- Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
- Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
- Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
- Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
- Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
- Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
- Koster, J., Rahmann, S. Snakemake–a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
- Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
- Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
- Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
- Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).
