Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur
Summary
Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.
Abstract
Histone modifications constituent une composante majeure de l’épigénome et jouent un rôle réglementaire important dans la détermination de l’État transcriptionnel de loci associés. En outre, la présence de modifications spécifiques a été utilisée pour déterminer la position et l’identité non codantes des éléments fonctionnels comme améliorateurs. Ces dernières années, immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage de la génération suivant (ChIP-seq) est devenu un outil puissant pour déterminer les profils de génome des modifications des histones individuelles. Cependant, il est devenu plus en plus évident que les modèles combinatoires de modifications de la chromatine, appelées États de chromatine, déterminent l’identité et la nature du locus génomique associé. Par conséquent, les workflows consistant en des méthodologies (HT) haut débit robustes pour le profilage d’un certain nombre de marques de modification des histones, mais aussi des pipelines d’analyses informatiques capables de manipulation des myriades de ChIP-Seq profilage datasets, sont nécessaires pour détermination complète des États épigénomique en grand nombre d’échantillons. Le HT-ChIP-Seq workflow présenté ici se compose de deux modules : 1) un protocole expérimental pour le profilage de plusieurs modifications d’histone de petites quantités d’échantillons de tumeurs et de lignées cellulaires dans un format 96 puits ; et 2) un pipeline d’analyse de données informatiques qui combine des outils existants pour calculer les modèles d’état de la chromatine combinatoires et les occupation marque individuelle. Ensemble, ces deux modules de facilitent le traitement facile des centaines d’échantillons de ChIP-Seq de manière rapide et efficace. Le flux de travail présentée ici est utilisée pour dériver des modèles d’état de la chromatine de 6 profils de marque histone dans les tumeurs de mélanome et de lignées cellulaires. Dans l’ensemble, nous présentons un workflow de ChIP-seq complète qui peut être appliqué à des dizaines d’échantillons de tumeurs humaines et des lignées de cellules cancéreuses pour déterminer épigénomique aberrations dans diverses tumeurs malignes.
Introduction
La majorité des génomes de mammifères (98-99 %) est constituée de séquences non codantes, et ces régions nocoding contiennent des éléments régulateurs connus pour participer au contrôle de l’expression des gènes et la chromatine organisation1,2. Dans une cellule normale, l’assembly spécifique de l’ADN génomique dans la structure de la chromatine compactée est critique pour l’organisation spatiale, le règlement et le calendrier précis de divers processus liés à l’ADN3,4,5. Dans une cellule cancéreuse Toutefois, des modifications de la chromatine par des mécanismes épigénétiques aberrants peuvent conduire à une mauvaise organisation de la structure de la chromatine, notamment l’accès aux éléments de régulation, systèmes de bouclage chromosomiques et gene expression patterns6, 7,8,9,10.
Malgré des progrès récents, nous avons limité la compréhension des altérations épigénétiques qui sont associés à la progression tumorale ou de la réponse thérapeutique. L’épigénome consiste en un tableau des modifications, y compris les marques histone et la méthylation de l’ADN, qui composent un état dynamique (dénommé État de la chromatine) qui empiète sur les réseaux de l’expression génique et autres processus essentiels pour le maintien identité cellulaire. Récemment, altérations de rehausseurs ont été présentées dans plusieurs tumeurs malignes en étudiant H3K27Ac profils11. Bien que ces études permettent de mieux comprendre la corrélation entre les marques épigénétiques isolés, plus de 100 modifications épigénétiques ont été identifiés12,,13 , sans une compréhension claire de leurs rôles biologiques et interdépendance. En outre, il y a un nombre encore plus grand des modèles combinatoires possibles de ces histones et les modifications de l’ADN, et c’est ces modèles combinatoires – modifications non individuels – qui dictent les États épigénétiques14. Par conséquent, il y a un besoin énorme d’identifier les altérations dans ces États de la chromatine au cours de la progression du cancer ou des réponses à la thérapie. Connaissance approfondie de l’épigénome altérations dans les cancers a été en retard en partie en raison de la technique (par exemple la génération de données à grande échelle de petite quantité de cellules cliniques de matériel/single) et analytique (par exemple des algorithmes pour définir défis de combinatoire d’États). Par conséquent, il est besoin critique de Méthodes robustes de haut-débit pour profiler le grand nombre de marques modification histone de matériel clinique et easy-to-implement approches informatiques pour prédire la combinatoire qui facilitera détermination des États épigénétiques associé à différentes étapes de la tumorigenèse et de résistance thérapeutique. Données supplémentaires, de récentes épigénome profilage études15,16,17,18,19,20,21, 22,23 dans les tissus normaux et les lignées cellulaires peuvent être intégrées aux profils de la chromatine des tumeurs pour plus amples aperçus épigénome contribution à la biologie de la tumeur.
Profilage de la chromatine est devenu un puissant outil pour identifier les profils de liaison globale des divers chromatine modifications15,24. Ces dernières années, ChIP-seq est devenu le « gold standard » pour l’étude des interactions ADN-protéines sur une échelle mondiale25,26,27. Pour toute expérience de ChIP-seq, il y a des étapes critiques nécessaires à son succès, y compris la dissociation et le traitement de tissus, de constatation dans des conditions optimales sonication, déterminer la concentration en anticorps optimal pour les précipitations, préparation de la bibliothèque, traitement des données après séquençage et analyse en aval. Chacune de ces étapes contiennent des points de contrôle clés contrôle de la qualité et ensemble, sont indispensable pour bien identifier les cibles potentielles pour la validation fonctionnelle. Grâce à l’innovation dans ces étapes, plusieurs études antérieures ont élaboré des méthodes pour effectuer une puce ou un ChIP-Seq de petite quantité de tissus28,29,30,31,32 . De plus, certaines études ont suggéré des protocoles pour les expériences de puce haut débit suivies par PCR basée quantification33,34. Enfin, certaines plates-formes d’analyse disponibles publiquement pour ChIP-Seq données sont maintenant disponibles comme Easeq35 et36de la galaxie. Cependant, une plate-forme intégrée pour effectuer des ChIP-Seq dans un mode haut-débit en combinaison avec un pipeline calcul pour effectuer la marque unique ainsi que des analyses d’état de la chromatine a fait défaut.
Ce protocole décrit un workflow de ChIP-seq complète et global pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les tissus de la tumeur et de lignées cellulaires, avec facile à suivre les lignes directrices qui englobe toutes les étapes nécessaires pour une expérience réussie. En adoptant une méthode de haut débit, déjà décrite par Blecher-Gonen et al. 37, ce protocole peut être effectué sur des dizaines d’échantillons en parallèle et a été appliqué avec succès sur des lignées de cellules cancéreuses et tumeurs humaines telles que le mélanome, côlon, prostate et glioblastome multiforme. Nous démontrons la méthodologie pour six modifications d’histone de base qui représentent des composantes clés du paysage réglementaire épigénétique dans les lignées de cellules de mélanome humain et des échantillons de tumeur. Ces modifications incluent H3K27ac (exhausteurs), H3K4me1 (exhausteurs actives et posés), H3K4me3 (promoteurs), H3K79me2 (transcrit les régions), H3K27me3 (polycomb répression) et H3K9me3 (hétérochromatique répression). Ces marques utilisable seul ou en combinaison pour identifier des États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit un module complet et détaillé de ChIP-seq haut débit pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les lignées de cellules et tissus tumoraux humains. Dans n’importe quel protocole de ChIP-seq, une des étapes plus importantes est la spécificité de l’anticorps. Ici, cette méthode illustre l’immunoprécipitation des conditions pour les décrit six modifications d’histone, qui sont de qualité ChIP et ont été déjà validés dans notre et d’autres laboratoires<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Marcus Coyle, Curtis Gumbs, noyau SMF au MDACC pour le soutien de séquençage. Le travail décrit dans cet article a été soutenu par des subventions de la subvention du NIH (CA016672) à base de SMF et NCI récompenses (1K99CA160578 et R00CA160578) K. R.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
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