Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Abstract

Modificações do histone constituem um componente importante do Epigenoma e desempenham importantes funções reguladoras na determinação do estatuto transcriptional dos loci associados. Além disso, a presença de alterações específicas tem sido usada para determinar a posição e a identidade não-codificante funcional elementos como potenciadores. Nos últimos anos, a imunoprecipitação da cromatina, seguida de próxima geração sequenciação (ChIP-seq) tornou-se uma poderosa ferramenta para determinar os perfis de todo o genoma de modificações do histone individuais. No entanto, tornou-se cada vez mais claro que os padrões de combinatórios de modificações da cromatina, referidos como Estados de cromatina, determinam a identidade e a natureza do locus genômico associado. Portanto, os fluxos de trabalho consistindo de robustas metodologias de (HT) de alta produtividade para criação de perfil de um número de marcas de modificação de histona, bem como dutos de análises computacionais capazes de lidar com miríades de ChIP-Seq perfis de conjuntos de dados, são necessários para determinação abrangente dos Estados epigenomic em grande número de amostras. O HT-ChIP-Seq de fluxo de trabalho aqui apresentado é composto por dois módulos: 1) um protocolo experimental para o perfilamento várias modificações do histone de pequenas quantidades de amostras de tumor e linhas de células em um formato de 96 poços; e 2) um pipeline de análise de dados computacional que combina as ferramentas existentes para calcular tanto marca individual ocupação e padrões de estado cromatina combinatória. Juntos, esses dois módulos facilitam fácil processamento de centenas de amostras de ChIP-Seq de forma rápida e eficiente. O fluxo de trabalho apresentado aqui é usado para derivar padrões de cromatina estado 6 perfis de marca de histona em tumores de melanoma e linhas celulares. Em geral, apresentamos um fluxo de trabalho de ChIP-seq abrangente que pode ser aplicado a dezenas de amostras de tumor humano e linhas de células de câncer para determinar epigenomic de aberrações em várias malignidades.

Introduction

A maioria dos genomas de mamíferos (98-99%) é composta de sequência não-codificadoras e nestas regiões nocoding contêm elementos reguladores conhecidos para participar no controle da expressão gênica e cromatina organização^1,2. Em uma célula normal, o assembly específico do DNA genômico na estrutura da cromatina compactada é fundamental para a organização espacial, a regulação e a cronometragem precisa de vários processos de DNA associada^3,4,5. Em uma célula de câncer, no entanto, as modificações de cromatina por aber....

Protocol

Todas as amostras clínicas foram obtidas seguindo as orientações do Conselho de revisão institucional.

1. preparação buffer

1. Fazer 200 mL de tampão TE (Tris-HCl, pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 10mm 8.0 de 10 mM).
2. Fazer 200 mL de tampão STE (10 mM Tris-HCl, pH de EDTA 10 mM 8.0, 140 mM de NaCl).
3. Fazer 200 mL de glicina 2,0 M (37,52 g de glicina em 200 mL de água) e aquecê-lo a 65 ° C.
4. Fazer 200 mL de solução a 5% de sódio deoxycholate (DOC) (10 g de DOC em 200 mL de água).
5. Fazer 500 mL de tampão de colheita de ChIP (12 mM Tris-Cl, 0,1 x solução salina tampão fosfato (PBS....

Results

Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos de tumor congelado e linhas celulares que podem ser executadas em dezenas de amostras em paralelo usando um método de alta produtividade (figura 1A). Fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bps para a imunoprecipitação ideal. Temos observado que o tempo necessário para atingir o mesmo comprimento de corte é diferente para diferentes tecidos e tipos de células. O sucesso do Ch.......

Discussion

Este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq da elevado-produção completo e abrangente para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano e linhas celulares. Em qualquer protocolo de ChIP-seq, um dos passos mais importantes é a especificidade do anticorpo. Aqui, esse método ilustra imunoprecipitação condições para as modificações do histone seis descritos, os quais são ChIP-grau e validados anteriormente em nosso e outros laboratórios^42,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo H3K4me1 de grau ChIP	Abcam	ab8895
Anticorpo H3K27ac de grau ChIP	Abcam	ab4729
Anticorpo H3K4me3 de grau ChIP	Abcam	ab8580
Anticorpo H3K79me2 de grau ChIP	Abcam	ab3594
Anticorpo H3K27me3 de grau	ChIP Abcam	ab6002
H3K9me3 de grau ChIP anticorpo	Abcam	ab8898
1M Tris HCl, pH 8,0	Teknova	T1080
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glicina	Sigma-Aldrich	G8898
Desoxicolato de sódio	Sigma-Aldrich	30970
DPBS	Sigma - Vida Sciences	D8537-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	74255
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100-100ML
LiCl	Sigma-Aldrich	746460
NP-40	Calbiochem	492016-100ML
1% TWEEN-20	Fisher Biorreagentes	BP337-500
BSA - Sigma sem	IgG - Vida Sciences	A2058-5G
HBSS	Gibo	14025092
GentleMACS C tube	GentleMACS	120-008-466	tubo de dissociação
16% Formaldeído	Peierce	28906
inibidor de miniProtease	inibidores de protease	11836153001	Roche Diagnostics
Dynabeads Protein G	Tubos Invitrogen	10009D
Bioruptor NGS 0,65 mL	Diagenode	C30010011	tubos de sonicação
DynaMag - 96 Side Skirted	Invitrogen	120.27	Suporte magnético de 96 poços
TE buffer	Promega	V6231
RNase A	Invitrogen	12091021
Proteinase K	Invitrogen	100005393
Grânulos AMPure XP	Beckman Coulter	A63882	grânulos paramagnéticos
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Qubit ds DNA Kit de ensaio de alta sensibilidade	Invitrogen	Q32854	reagentes de DNA de alta sensibilidade
NEBNext Ultra II Kit de preparação para biblioteca de DNA	New England BioLabs	E7645L	Kit de preparação para biblioteca
de DNA Água livre	de nucleaseAmbion	AM9932
Fita de Tela D1000 de Alta Sensibilidade	Agilent Technologies	5067-5584	reagentes de DNA de alta
sensibilidade Reagentes D1000 de alta sensibilidade	Agilent Technologies	5067-5585	reagentes de DNA de alta sensibilidade
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)	New England BioLabs	E7335L	Multiplex Oligos
Oligos Multiplex (Primers de índice- Conjunto 2)	New England BioLabs	E7500L	Multiplex Oligos
TapeStation 4200	Agilent Technologies	G2991AA	instrumento de eletroferograma de DNA de alta sensibilidade
Dispositivo de sonicação Bioruptor Pico	Misturador de divisor de banho-maria	Diagenode	B01060001
	Nutator	421105
Bio-Rad C1000 Touch Termociclador	Bio-Rad	1851196	PCR Termociclador
Banho de Água	Fisher Scientific	2322
Pipeta Multicanal	Denville	1003123
Tubo Revólver	Thermo-Scientific
Placa de Rodapé de 96 Poços	Eppendorf	47744-110
Allegra X-12R Centrífuga	Centrífuga de bancada	Beckman Coulter	A99464
Centrífuga	Eppendorf	22620461	Tiras
de tubo óptico (8x Strip)	Agilent Technologies	401428
Tampas de tira de tubo óptico (8x tira)	Agilent Technologies	401425
Dicas de Carregamento, 10 Pk	Agilent Technologies	5067-5599
Vórtice IKA MS3 Vórtice	IKA	3617000