腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム
Summary
ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム クロマチン状態パターンの定量計算解析パイプラインについて述べる。
Abstract
ヒストン修飾は、エピゲノムの主要なコンポーネントを構成して、関連する遺伝子の転写のステータスを決定する上で重要な規制の役割を果たします。さらに、特定の変更の有無は位置とエンハンサーなどの id 以外のコーディング機能要素を決定するために使用されています。近年、次世代シーケンシング (チップ seq) 続いてクロマチン免疫沈降個々 のヒストンの修正のゲノム全体のプロファイルを決定する上で強力なツールとなっています。ただし、クロマチン状態と呼ばれる、クロマチン修飾の組み合わせパターンが id と関連付けられた genomic 位置の性質を決定することがますます明らかになった。したがって、ヒストン修飾としてできる計算解析パイプラインの数をプロファイリングのしっかりした高スループット (HT) 方法論から成るワークフロー処理チップ Seq の無数のデータセットをプロファイリングのために必要な多くのサンプル数でエピゲノム状態の包括的な決定は。ここに提示、HT チップ Seq ワークフローは 2 つのモジュールで構成されています: 1) 少量の腫瘍のサンプルや 96 ウェル フォーマットで細胞からいくつかのヒストンの修正をプロファイリングのための実験プロトコル・ 2) 個々 のマークの占有と組合せクロマチン状態パターンの両方を計算するための既存のツールを組み合わせた計算データ解析パイプライン。一緒に、これら 2 つのモジュールは、簡単チップ Seq サンプルの何百もの高速かつ効率的に処理を促進します。ここに示すワークフローを使用して、黒色腫の細胞株 6 ヒストン マークのプロファイルからクロマチン状態パターンを派生します。全体的にみて、人間の腫瘍のサンプルと様々 な悪性腫瘍におけるエピゲノム異常を決定するがん細胞の数十に適用できる包括的なチップ seq ワークフローを提案します。
Introduction
哺乳類のゲノム (98-99%) の大半は非コード シーケンスから成るとこれらの nocoding 地域制御遺伝子の発現とクロマチン組織1,2に参加する知られている規制要素を。正常な細胞に最適化されたクロマチン構造にゲノム DNA の特定のアセンブリは空間的な組織、規制、様々 な DNA 関連プロセス3,4、5の精密なタイミングにとって重要です。癌細胞のしかし、クロマチン修飾におけるエピジェネティックな異常のメカニズムによってにつながる規制要素、染色体のループ システム、および遺伝子発現パターン6へのアクセスを含む、クロマチン構造の不適切な組織 7,8,9,10。
最近の進歩にもかかわらず、我々 は腫瘍の進行や治療の応答に関連付けられているエピジェネティックな変化の理解を限られています。エピゲノムは、ヒストンと DNA メチル化遺伝子発現ネットワークとその他のプロセスを維持するための重要な時に入射する (クロマチンの状態と呼ばれる) 動的状態を総称して形成を含む変更の配列で構成されています携帯電話の id です。最近、エンハンサーの変化は、H3K27Ac プロファイル11を研究することによって複数の悪性腫瘍で示されています。このような研究は、分離のエピゲノムの相関性への洞察力を提供する、以上 100 エピジェネティック修飾はその生物学的役割を明確に理解することがなく識別された12,13をされていると相互依存関係。さらに、これらのヒストンと DNA の変更の組合せパターンのさらに大きな数があるし、それはこれら組み合わせパターンの個々 の変更 – エピジェネティックな状態14を指示します。したがって、癌の進行や治療.への応答時にこれらのクロマチンの状態の変化を識別するために途方もない必要性があります。技術 (臨床材料/単一セルの少量から大規模なデータ生成など) の一部に遅れている癌のエピゲノム変化の包括的な知識と分析 (例えばアルゴリズムを定義するには組合せ状態) の課題。したがって、容易にする組合せのパターンを予測する臨床材料と簡単に実装できる計算のアプローチからヒストン修正マークの数が多いをプロファイリングのための堅牢な高スループット方法の重要な必要性があります。腫瘍と治療抵抗性のさまざまな段階に関連付けられているエピジェネティクスの状態の決定。さらに、データ最近エピゲノム プロファイリング研究15,16,17,18,19,20,21から利用できます。 22,23の正常組織および細胞は腫瘍の腫瘍生物学へのエピゲノム貢献のさらなる洞察のクロマチン プロファイルに統合できます。
クロマチンのプロファイリングを様々 なクロマチン変更15,24の大域結合パターンを識別するための強力なツールとなりました。近年、チップ seq を地球規模25,26,27DNA 蛋白質の相互作用を研究するための「ゴールド スタンダード」となりました。任意のチップ seq 実験のためティッシュの処理および脱退を含め、最適な超音波処理条件、沈殿物、ライブラリの準備のための最適な抗体濃度を決定を決定、その成功のために必要な重要なステップがあります。ポスト シーケンス データの処理、および下流の分析。これらの各手順キーの品質管理のチェックポイントが含まれて、一緒に撮影するとき正しく機能検証のための潜在的なターゲットを識別するために重要です。次の手順でイノベーションにより、いくつかの先行研究が組織28,29,30,31,32 の少量からチップやチップ Seq を実行する手法を開発しました。.さらに、いくつかの研究は、PCR によって続いた高スループット チップ実験用プロトコルによる定量33,34を示唆しています。最後に、チップ Seq データのいくつかの公に利用可能な解析プラットフォームは、Easeq35銀河36などできます。ただし、クロマチン状態分析と同様に、ひとつのマークを実行する計算パイプラインとの組み合わせで高スループット方法でチップ Seq を実行するための統合プラットフォームを欠いてきた。
このプロトコルと腫瘍組織および培養細胞におけるクロマチン状態のゲノム マッピングのための完全かつ包括的なチップ seq ワークフローを成功した実験のために必要な手順のすべてを包み込むガイドラインに従う簡単な記述します。Blecher ゴネンらに記載された高スループット方法を採用することにより37, このプロトコル並列でサンプルの数十に実行でき、癌細胞、悪性黒色腫、大腸、前立腺、膠芽腫多形性など人間の腫瘍に正常に適用されています。ひと悪性黒色腫細胞と腫瘍サンプルのエピジェネティックな規制環境の主要なコンポーネントを表す六つのコアのヒストンの修正の方法を示す.これらの変更は、H3K27ac (エンハンサー)、H3K4me1 (アクティブと態勢を整えてエンハンサー) H3K4me3 (プロモーター) H3K79me2 (転写領域)、H3K27me3 (ポリコーム抑制) と H3K9me3 (多色抑圧)。これらのマークは、抑圧的なアクティブなドメインを表す機能的に異なるクロマチンの状態を識別するために単独でまたは組み合わせて使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、ひと腫瘍組織および培養細胞におけるクロマチン状態のゲノム マッピングの完全かつ包括的な高スループット チップ seq モジュールについて説明します。最も重要な手順の 1 つは、任意のチップ seq プロトコル抗体特異性です。ここでは、このメソッドにより、チップ グレード、以前私たちと他研究所42,44,<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マーカス ・ コイル、カーティス ・ ガムス SMF コア MDACC シーケンスのサポートに感謝いたします。この資料で説明する作業は、SMF のコアに NIH グラント (CA016672) からの助成金によって支えられた、NCI は、k. r. に (1K99CA160578 および R00CA160578) に賞を受賞
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
Referências
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