Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.
Histon modifikasyonları epigenome önemli bir bileşeni oluşturur ve ilişkili loci transkripsiyon durumunu belirlemede önemli düzenleyici rol oynarlar. Buna ek olarak, belirli değişiklikler varlığı pozisyon ve kimlik arttırıcılar gibi kodlama-işlevsel öğeleri belirlemek için kullanılmıştır. Son yıllarda, sonraki nesil sıralama (ChIP-seq) tarafından takip Kromatin immunoprecipitation bireysel Histon değişiklikler genom çapında profilleri belirlemede güçlü bir araç haline gelmiştir. Ancak, Kromatin değişiklikler, Kromatin Birleşik anılacaktır Kombinatorik şekillerinin kimlik ve ilişkili genomik locus doğasını belirlemek giderek netlik kazanmıştır. Bu nedenle, bir dizi Histon değişiklik işaretleri yanı sıra hesaplama analizleri boru hatları yetenekli profil oluşturma için sağlam yüksek üretilen iş (HT) metodolojisi oluşan iş akışları ChIP-Seq onbinlerce işleme veri profil oluşturma, için gerekli epigenomic Birleşik Devletleri çok sayıda örnekleri kapsamlı belirlenmesi. Burada sunulan HT-ChIP-Seq iş akışı iki modülden oluşmaktadır: 1) tümör örnekleri ve hücre hatları bir 96-iyi biçimde; küçük miktarlarda birkaç Histon bazı değişiklikleri profil oluşturma için deneysel bir protokol ve 2) bireysel işareti doluluk ve Kombinatorik Kromatin devlet desenleri hesaplamak için varolan araçları birleştiren bir sayısal veri analiz boru hattı. Birlikte, bu iki modül ChIP-Seq örnekleri yüzlerce kolay hızlı ve verimli bir şekilde işleme kolaylaştırmak. Burada sunulan iş akışı 6 Histon Ilhan profilleri Melanom tümörler ve hücre satırlarını Kromatin devlet desenleri türetmek için kullanılır. Genel olarak, biz onlarca insan tümör örnekleri ve kanser hücre hatları çeşitli maligniteler epigenomic anomalileri belirlemek için uygulanabilir kapsamlı bir çip seq iş akışı mevcut.
Memeli genleri (98-%99) çoğunluğu kodlamayan dizisi oluşmaktadır ve bu nocoding bölgeler gen ekspresyonu ve Kromatin kuruluş1,2kontrolünde katılmak için bilinen yasal öğesinde yer. Normal bir hücrede, sıkıştırılmış Kromatin yapısı belirli derlemeye genomik DNA’ın mekansal organizasyon, düzenleme ve çeşitli DNA ilişkili işlemler3,4,5hassas zamanlama için önemlidir. Bir kanser hücresi ancak, Kromatin değişiklikler anormal epigenetik mekanizmalar tarafından uygun olmayan düzenleyici elemanlarının, kromozom döngü sistemleri ve gen ifade desenleri6erişim dahil olmak üzere Kromatin yapısı, organizasyonu yol açabilir, 7,8,9,10.
Son gelişmeler rağmen biz anlayış tümör ilerlemeyi veya terapötik yanıt ile ilişkili epigenetik değişiklikler sınırlıdır. Epigenome değişiklikler, Histon izleri ve DNA metilasyonu, topluca gen ifade ağları ve diğer işlemler korumak için kritik önem üzerine gelmesi (Kromatin devlet olarak adlandırılır) dinamik bir devlet oluşturmak da dahil olmak üzere bir dizi oluşur hücresel kimlik. Son zamanlarda, değişiklikler arttırıcılar içinde birden çok maligniteler H3K27Ac profilleri11inceleyerek gösterilmiştir. Bu tür çalışmalar izole epigenetik işaretleri korelasyon içgörü sağlamak rağmen 100’den fazla epigenetik değişiklikler belirlenen12,13 biyolojik rolleri net anlayış olmadan edilmiştir ve karşılıklı bağımlılık. Ayrıca, orada bu Histon ve DNA değişiklikler olası Kombinatorik desenleri daha büyük bir dizi ve epigenetik Birleşik14dikte bu Kombinatorik kalıpları – değil tek tek değişiklikleri – öyle. Bu nedenle, kanser ilerleme ya da terapi. yanıt sırasında değişiklikler bu Kromatin Birleşik Devletleri tanımlamak için muazzam gerek yoktur Kapsamlı bilgi epigenome değişikliklerini kanserleri ahşap kaplama kısmen teknik (örneğin klinik malzeme/tek hücreleri küçük bir miktar büyük ölçekli veri üretme) nedeniyle ve analitik (tanımlamak içinörneğin algoritmaları Kombinatorik Birleşik) Zorluklar. Bu nedenle, çok kritik ihtiyaç Histon değişiklik işaretleri klinik malzeme ve uygulamak kolay Hesaplamalı yaklaşımlar çok sayıda profil oluşturma için sağlam yüksek üretilen iş yöntemleri için kolaylaştıracaktır Kombinatorik desenleri tahmin etmek tumorigenesis ve tedavi direnci farklı aşamalarında ile ilişkili epigenetik Birleşik belirlenmesi. Ayrıca, veriler son epigenome profil oluşturma çalışmaları15,16,17,18,19,20,21, 22,23 normal dokuların ve hücre satırlarını Kromatin profilleri daha da epigenome katkı tümör biyolojisi anlayışlar için tümörlerin ile entegre olabilir.
Kromatin profil oluşturma çeşitli Kromatin değişiklikler15,24küresel bağlama kalıpları tanımlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda, ChIP-seq “altın DNA-protein etkileşimler bir küresel ölçekte25,26,27üzerinde çalışmak için standart” haline gelmiştir. Herhangi bir çip seq deneme için doku işleme ve ayırma dahil, en uygun sonication koşulları, yağış, Kütüphane hazırlık için en uygun antikor yoğunlaşması belirleneceği belirleneceği, başarı için gerekli kritik adımlar vardır, veri işleme ve aşağı akım analiz sonrası sıralanıyor. Bu adımların her biri, anahtar kalite kontrol denetim noktaları içeren ve birlikte alındığında düzgün işlev doğrulama için olası hedefler belirlemek için önemlidir. Bu adımda yenilik metodolojileri ChIP veya çip Seq doku28,29,30,31,32 az miktarda gerçekleştirmek için çeşitli önceki çalışmalarda geliştirdik . Ayrıca, bazı çalışmalarda yüksek işlem hacmi ChIP deneyler PCR tarafından takip protokollerde Nefelometri33,34dayalı düşündürmektedir. Son olarak, bazı yayım kullanılabilir analiz platformlar ChIP-Seq veri için şimdi Easeq35 ve Galaxy36gibi kullanılabilir. Ancak, tek işareti ve Kromatin devlet analizleri gerçekleştirmek için sayısal bir boru hattı ile birlikte yüksek üretilen iş moda ChIP-Seq gerçekleştirmek için entegre bir platform eksik edilmiştir.
Bu iletişim kuralı tümör doku ve hücre hatları, Kromatin durumlarda genom geniş eşleme için bir tam ve çok yönlü ChIP-seq iş akışı ile kolay başarılı bir deneme için gerekli adımların tümünü kapsayan yönergeleri yerine getirmeniz açıklar. Daha önce Blecher-Gönen vd tarafından açıklanan bir yüksek-den geçerek yöntemi benimseyerek 37, bu protokolü örnekleri paralel onlarca üzerinde gerçekleştirilen ve kanser hücre satırları ve Melanom, kolon, prostat ve glioblastoma multiforme gibi insan tümörlerin başarıyla uygulandı. Biz insan melanoma hücre satırları ve tümör örnekleri epigenetik düzenleyici peyzaj anahtar bileşenlerini temsil eden altı çekirdekli Histon değişiklikler için metodoloji göstermek. Bu değişiklikler H3K27ac içerir (arttırıcılar), H3K4me1 (aktif ve hazır arttırıcılar), H3K4me3 (Organizatör), H3K79me2 (transkripsiyonu bölgeler), H3K27me3 (polycomb baskı) ve H3K9me3 (heterochromatic baskı). Bu işaretler baskıcı ve etkin etki alanları temsil eden işlevsel olarak farklı Kromatin Birleşik tanımlamak için tek başına veya birlikte kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı genom geniş eşleme Kromatin durumlarda insan tümör doku ve hücre hatları için tam ve çok yönlü yüksek işlem hacmi ChIP-seq modülü açıklar. Herhangi bir çip seq protokolünde antikor özgüllük en önemli adımlardan biridir. Burada, immunoprecipitation koşullar tüm bunların ChIP-Grade ve daha önce bizim diğer laboratuvarlar42,44,ve45 doğrulanmış açıklanan altı Histon değişiklik…
The authors have nothing to disclose.
Marcus Coyle, Curtis Gumbs, MDACC SMF özünde sıralama destek için teşekkür ediyoruz. Bu makalede açıklanan çalışma NIH grant (CA016672) dan gelen hibe için SMF çekirdek tarafından desteklenen ve ncı K. R. (1K99CA160578 ve R00CA160578) Ödülleri
ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
HBSS | Gibo | 14025092 | |
GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
TE buffer | Promega | V6231 | |
RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
Mixer | Nutator | 421105 | |
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |