Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels
Summary
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.
Abstract
Histon modificaties vormen een belangrijk onderdeel van de epigenome en spelen een belangrijke regelgevende rol bij het bepalen van de transcriptionele status van geassocieerde loci. Daarnaast is de aanwezigheid van specifieke wijzigingen gebruikt om te bepalen van de positie en de identiteit niet-coderende functionele elementen zoals versterkers. In de afgelopen jaren, chromatine immunoprecipitation, gevolgd door sequentiebepaling van volgende generatie (ChIP-seq) uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel bij het bepalen van de genoom-brede profielen van individuele histone modificaties. Echter is het steeds duidelijker dat de combinatorische patronen van chromatine wijzigingen, hierna aangeduid als de chromatine-Staten, de identiteit en aard van de bijbehorende genomic locus bepalen geworden. Daarom, werkstromen bestaande uit robuuste high-throughput methodologieën voor profilering van een aantal Histon wijziging merken, evenals de computationele analyses pijpleidingen staat (HT) behandeling van myriaden ChIP-Seq profiling datasets, nodig zijn voor alomvattende bepaling van epigenomic Staten in groot aantal monsters. De HT-ChIP-Seq werkstroom gepresenteerde bestaat uit twee modules: 1) een experimenteel protocol voor profilering van de verschillende histone modificaties van kleine hoeveelheden tumor monsters en cellijnen in een 96-Wells-formaat; en 2) een computationele data analyse pijpleiding die combineert bestaande instrumenten om te berekenen zowel individueel merk bezetting en combinatorische chromatine staat patronen. Beide modules vergemakkelijken samen gemakkelijk verwerken van honderden ChIP-Seq monsters in een snelle en efficiënte manier. De werkstroom hier gepresenteerd wordt gebruikt voor het afleiden van chromatine staat patronen uit 6 Histon mark profielen in melanoom tumoren en cellijnen. Globaal, presenteren we een uitgebreide ChIP-seq workflow die kan worden toegepast op tientallen menselijke tumor monsters en cellijnen van de kanker te bepalen epigenomic afwijkingen in verschillende maligniteiten.
Introduction
Het merendeel van de zoogdieren genoom (98-99%) bestaan uit noncoding opeenvolging, en deze nocoding gebieden bevatten regelgevende elementen bekend om deel te nemen bij het beheersen van genexpressie en1,2van de organisatie van de chromatine. In een normale cel is de specifieke vergadering van genomic DNA in gecomprimeerde chromatine structuur essentieel voor de ruimtelijke organisatie, de regelgeving en de precieze timing van de verschillende DNA-geassocieerde processen3,–4,5. In een kankercel maar kunnen chromatine wijzigingen door aberrant Epigenetische mechanismen leiden tot onjuiste organisatie van de structuur van de chromatine, met inbegrip van toegang tot de regelgevende elementen, chromosomale looping systemen en gen expressie patronen6, 7,8,9,10.
Ondanks de recente vooruitgang, hebben we beperkte begrip van epigenetische veranderingen die gekoppeld aan de progressie van de tumor of therapeutische respons zijn. De epigenome bestaat uit een matrix van wijzigingen, met inbegrip van Histon merken en methylation van DNA, die gezamenlijk een dynamische staat vormen (hierna: chromatine staat) die inbreuk op gen expressie netwerken en andere processen essentieel voor het behoud van maakt cellulaire identiteit. Onlangs, wijzigingen in de versterkers is aangetoond in meerdere maligniteiten door het bestuderen van H3K27Ac profielen11. Hoewel dergelijke studies inzicht geven in de correlatie van geïsoleerde epigenetische merken, meer dan 100 epigenetische aanpassingen geweest geïdentificeerde12,,13 zonder duidelijk begrip van hun biologische rol en onderlinge afhankelijkheid. Bovendien, er is een nog groter aantal mogelijke combinatorische patronen van deze histone en DNA wijzigingen, en het is deze combinatorische patronen – niet afzonderlijke wijzigingen – die epigenetische Staten14 dicteren. Vandaar, is er grote behoefte vast te stellen van wijzigingen in deze Staten chromatine tijdens de progressie van kanker of reacties op therapie. Grondige kennis van epigenome veranderingen in kanker heeft gedeeltelijk is achtergebleven als gevolg van technische (bv . generatie van grootschalige gegevens uit kleine hoeveelheid klinisch materiaal/enkele cellen) en analytische (bijvoorbeeld algoritmen te definiëren Combinatorische Staten) uitdagingen. Daarom is er dringend behoefte voor robuuste hoge gegevensdoorvoer methoden voor profilering groot aantal Histon wijziging merken uit klinisch materiaal en gemakkelijk te implementeren computationele benaderingen te voorspellen combinatorische patronen die zal vergemakkelijken bepaling van de epigenetische staten verschillende stadia van tumorvorming en therapeutische weerstand is gekoppeld. Verder gegevens beschikbaar van recente epigenome profiling studies15,16,17,18,19,20,21, 22,23 in normale weefsels en cellijnen kan worden geïntegreerd met de chromatine profielen van tumoren voor verdere inzichten in epigenome bijdrage aan tumor biologie.
Chromatine profilering is een krachtig hulpmiddel voor de identificatie van de globale bindende patronen van verschillende chromatine wijzigingen15,24geworden. In de afgelopen jaren is de ChIP-seq uitgegroeid tot de “gouden standaard” voor de studie van DNA-eiwit interactie op een wereldwijde schaal25,26,27. Voor elke ChIP-seq-experiment zijn er kritische stappen nodig zijn voor het succes, met inbegrip van de verwerking van het weefsel en scheiding, determing optimale ultrasoonapparaat voorwaarden, determing optimale antilichaam concentratie voor neerslag, bibliotheek voorbereiding, verwerking van de gegevens van de post sequencing en downstream-analyse. Elk van deze stappen bevatten belangrijke kwaliteitscontrole controleposten en wanneer samen genomen, zijn van cruciaal belang voor het correct identificeren van potentiële doelen voor functionele validering. Door middel van innovatie in deze stappen, hebben verschillende voorafgaande studies ontwikkeld methodologieën voor het uitvoeren van ChIP of ChIP-Seq van kleine hoeveelheid weefsels28,29,30,31,32 . Verder, hebben sommige studies voorgesteld protocollen voor high-throughput ChIP experimenten gevolgd door PCR gebaseerd kwantificatie33,34. Tot slot, sommige platformen publiekelijk beschikbaar analyse voor ChIP-Seq gegevens zijn nu beschikbaar, zoals Easeq,35 pt36van de Galaxy. Echter, een geïntegreerd platform voor het uitvoeren van ChIP-Seq in een high-throughput mode in combinatie met een computationele pijpleiding voor het uitvoeren van interne mark evenals chromatin staat analyses heeft ontbroken.
Dit protocol beschrijft een complete en uitgebreide ChIP-seq workflow voor genoom-brede toewijzing van chromatine Staten in de weefsels van de tumor en cellijnen, met gemakkelijk te volgen richtsnoeren omvat alle van de stappen die nodig zijn voor een succesvolle experiment. Door het aannemen van een high-throughput methode beschreven door Blecher-Gonen et al. 37, dit protocol op tientallen monsters parallel kan worden uitgevoerd en is met succes toegepast op kanker cellijnen en menselijke tumoren zoals melanoom, dikke darm, prostaat en glioblastoma multiforme. We tonen de methodologie voor zes kern histone modificaties die belangrijke onderdelen van de epigenetische regelgevende landschap in menselijke melanoom cellijnen en tumor monsters vertegenwoordigen. Deze wijzigingen omvatten H3K27ac (enhancers), H3K4me1 (actief en klaar enhancers), H3K4me3 (initiatiefnemers), H3K79me2 (getranscribeerd regio’s), H3K27me3 (polycomb onderdrukking), en H3K9me3 (hétérochromatique onderdrukking). Deze merken kunnen alleen of in combinatie worden gebruikt voor identificatie van functioneel verschillende chromatine staten vertegenwoordigt zowel de actieve als de repressieve domeinen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een complete en uitgebreide high-throughput ChIP-seq module voor genoom-brede toewijzing van chromatine Staten in menselijke tumor weefsels en cellijnen. In een ChIP-seq-protocol is een van de belangrijkste stappen antilichamenspecificiteit. Hier, illustreert deze methode immunoprecipitation voorwaarden voor de beschreven zes histone modificaties, die allemaal zijn ChIP-rang en eerder zijn gevalideerd in onze en andere laboratoria42,44<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Marcus Coyle, Curtis Gumbs, SMF kern op MDACC voor sequencing ondersteuning. Het werk in dit artikel beschreven werd gesteund door subsidies van de NIH grant (CA016672) aan SMF Core en NCI awards (1K99CA160578 en R00CA160578) aan K. R.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
Referências
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
- Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
- Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
- Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
- Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
- Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
- Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
- Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
- Koster, J., Rahmann, S. Snakemake–a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
- Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
- Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
- Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
- Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).
