यहां हम murine भ्रूण के विकास के दौरान टेम स्टेम सेल पुरोगामी के क्लोनल विश्लेषण के लिए वर्तमान पद्धति । हम endothelial सेल सह संस्कृति और प्रत्यारोपण के साथ भ्रूण महाधमनी-gonad-mesonephros क्षेत्र से एकल कोशिकाओं के सूचकांक छंटाई गठबंधन phenotypic गुणों और एकल engraftment अग्रदूतों की टेम क्षमता को चिह्नित करने के लिए ।
भ्रूण के विकास के दौरान टेम स्टेम सेल (HSC) उत्पत्ति का अध्ययन करने की क्षमता प्रारंभिक भ्रूण में HSC पुरोगामी की दुर्लभता द्वारा सीमित किया गया है और परख की कमी है कि कार्यात्मक दीर्घकालिक multilineage engraftment की क्षमता की पहचान वैयक्तिक ख्यात HSC पुरोगामी. यहाँ, हम एक कोशिका स्तर पर कार्यात्मक मान्य HSC पुरोगामी के अलगाव और लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है कि पद्धति का वर्णन. सबसे पहले, हम प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से हल सेल के सटीक phenotypic पैरामीटर सूची छंटाई सूचकांक का उपयोग, प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए अतिरिक्त मार्करों के साथ HSC अग्रदूतों के लिए समृद्ध करने के लिए phenotypic मार्करों का एक संयोजन का उपयोग कर । दूसरा, प्रत्येक सूचकांक-क्रमबद्ध कोशिका महाधमनी-gonad-mesonephros (एजीएम) क्षेत्र है, जो गैर की परिपक्वता-engrafting HSC के साथ कार्यात्मक HSC के लिए पुरोगामी का समर्थन करता है, दीर्घकालिक multilineage क्षमता से नाड़ी आला स्ट्रोमा के साथ सह-संस्कृति है प्रत्यारोपण परख । यह पद्धति उनके कार्यात्मक engraftment क्षमता या transcriptional प्रोफ़ाइल जैसे अंय गुणों के साथ क्लोनल hemogenic अग्रदूतों के phenotypic गुणों के सहसंबंध को सक्षम करता है, HSC अग्रदूत के विस्तृत विश्लेषण के लिए एक साधन प्रदान सिंगल सेल स्तर पर विकास ।
क्लोनिंग अध्ययन वयस्क HSCs के दीर्घकालिक engraftment गुणों में विविधता से पता चला है, HSC उपप्रकार और1उंर बढ़ने के दौरान HSC व्यवहार में परिवर्तन में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करना । हालांकि, भ्रूण HSCs और उनके अग्रदूतों के समान अध्ययन और अधिक चुनौतीपूर्ण हो गया है । प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान, HSCs एक क्षणिक प्रक्रिया में hemogenic endothelium के रूप में जाना जाता है पुरोगामी की आबादी से उत्पन्न टेम संक्रमण के लिए endothelial के रूप में भेजा2. पहली HSC, उनकी क्षमता द्वारा परिभाषित करने के लिए मजबूत, दीर्घकालिक multilineage engraftment प्रदान करने के लिए वातानुकूलित वयस्क प्राप्तकर्ताओं में प्रत्यारोपण निंनलिखित, भ्रूण दिवस १०.५ (ई 10.5) में murine भ्रूण के बाद जब तक पता नहीं कर रहे हैं, बहुत कम आवृत्ति3 . उनके विकास के दौरान, HSC करने के लिए पुरोगामी (pre-HSC) hemogenic endothelium से उत्पन्न होने वाले वयस्क HSC के गुण प्राप्त करने से पहले परिपक्वता से गुजरना होगा जो प्रत्यारोपण परख में कुशल engraftment के लिए अनुमति देते हैं4,5 , 6. दुर्लभ HSC मूल, erythroid, माइलॉयड, और लसीकावत् क्षमता के साथ टेम progenitors की एक भीड़ के अध्ययन अस्पष्ट पहले से ही पूर्व HSC7,8से HSC के उद्भव के लिए पहले से पता चला रहे हैं । इस प्रकार, अंय टेम progenitors से पूर्व HSC भेद को क्लोनिंग कोशिकाओं को अलग करने और उंहें HSC को अपनी परिपक्वता के लिए पर्याप्त संकेतों के साथ प्रदान करने की आवश्यकता है, प्रत्यारोपण परख में उनके engraftment गुणों का पता लगाने के लिए ।
कई दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है जो या तो पूर्व vivo या vivo में परिपक्वता HSC द्वारा पूर्व HSC का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं । पूर्व vivo तरीकों भ्रूण के ऊतकों की संस्कृति पर निर्भर किया है, जैसे एजीएम क्षेत्र है, जहां पहली HSC विकास9में पता चला रहे हैं । इन तरीकों पर बिल्डिंग, प्रोटोकॉल जो पृथक्करण शामिल, छंटाई, और फिर से आमसभा के ऊतकों के एकत्रीकरण हल आबादी के लक्षण वर्णन की अनुमति दी है विकास के दौरान HSC अग्रदूतों ई 9.5 के पैरा में e 11.5 से महाधमनी splanchnopleura (पी-एसपी)/AGM क्षेत्रको४,५,१०; हालांकि, इन approaches क्लोनल विश्लेषण के लिए आवश्यक एकल कक्ष स्तर पर पुरोगामी के उच्च प्रवाह विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं । इसी तरह, नवजात चूहों में प्रत्यारोपण द्वारा vivo परिपक्वता में , जहां microenvironment HSC अग्रदूतों के पहले के चरणों के समर्थन के लिए और अधिक उपयुक्त होने के लिए माना है, भी की जर्दी थैली और एजीएम से क्रमबद्ध आबादी का अध्ययन सक्षम/ पी-एसपी (पी-एसपी एजीएम को प्रणेता क्षेत्र है) पूर्व HSC की विशेषताओं के साथ, लेकिन इन तरीकों को भी एकल सेल विश्लेषण11,12के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करने में विफल ।
Rafii एट अल से अध्ययन किया है कि एकेटी-सक्रिय endothelial सेल (ईसी) स्ट्रोमा इन विट्रो13,14,15में वयस्क HSC स्व-नवीकरण के समर्थन के लिए एक आला सब्सट्रेट प्रदान कर सकते हैं । हमने हाल ही में तय किया है कि एकेटी एजीएम क्षेत्र से व्युत्पन्न चुनाव आयोग (एजीएम-ईसी) hemogenic पुरोगामी की परिपक्वता के लिए एक विट्रो में उपयुक्त प्रदान करता है, के रूप में विकास में E9 के रूप में जल्दी पृथक, वयस्क-engrafting HSC, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में बाद जनित HSC का स्व-नवीकरण16. यह देखते हुए कि इस प्रणाली के एक सरल 2 आयामी सह संस्कृति को रोजगार, यह व्यक्तिगत रूप से पृथक hemogenic पुरोगामी की HSC क्षमता का क्लोनल विश्लेषण के लिए आसानी से अनुकूलनीय है ।
हम हाल ही में परख के लिए एक दृष्टिकोण की सूचना दी है HSC क्लोनी hemogenic अग्रदूतों के एजीएम के साथ murine भ्रूण से व्यक्तिगत hemogenic अग्रदूतों की छंटाई सूचकांक-चुनाव आयोग सह संस्कृति और बाद में प्रत्यारोपण में कार्यात्मक विश्लेषण के संयोजन के द्वारा संभावित 17परख । अनुक्रमणिका सॉर्टिंग प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) जो अभिलेख (अनुक्रमणिका) सभी phenotypic पैरामीटर्स (, अग्रेषित स्कैटर (FSC-a), साइड स्कैटर (SSC-a), प्रतिदीप्ति पैरामीटर्स) के प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से सॉर्ट किए गए कक्ष का एक मोड है ऐसी है कि इन सुविधाओं को क्रमिक रूप से सॉर्ट करने के बाद कार्यशील विश्लेषण से संबद्ध किया जा सकता है । FACS सॉफ्टवेयर प्रत्येक कोशिका के लिए दोनों phenotypic जानकारी रिकॉर्ड और ९६-खैर प्लेट जिसमें यह रखा गया था की स्थिति/ यह तकनीक पहले से खूबसूरती से वयस्क HSC में विविधता की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, phenotypic पैरामीटर है कि आगे HSC के दीर्घकालिक engrafting सबसेट के लिए समृद्ध का निर्धारण, और phenotypic के HSC मानकों के transcriptional के साथ सहसंबंधी बनाना एकल कक्ष स्तर18,19पर गुण । यहां, हम इस दृष्टिकोण है कि अद्वितीय phenotypic मापदंडों और भ्रूण विकास की प्रारंभिक अवस्था के दौरान पूर्व HSC के वंश योगदान की पहचान में सक्षम बनाता है की विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं ।
भ्रूण विकास आवश्यक के दौरान HSC उत्पत्ति के अध्ययन के लिए hemogenic अग्रदूतों में HSC क्षमता का पता लगाने के लिए अभी तक क्षमता की कमी के लिए दीर्घकालिक multilineage टेम पुनर्गठन में प्रत्यारोपित वयस्क प्राप्तकर्ताओं प?…
The authors have nothing to disclose.
हम FACS के साथ सहायता के लिए फ्रेड Hutchinson प्रवाह Cytometry कोर में एंड्रयू बर्गर, स्टेसी Dozono, और ब्रायन ̈रदें शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस कार्य के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य NHLBI UO1 अनुदान #HL100395, सहायक सहयोगी अनुदान #HL099997, और NIDDK अनुदान #RC2DK114777 का समर्थन किया गया. ब्रेंडन Hadland है एलेक्स नींबू पानी स्टैंड फाउंडेशन और हुंडई व्हील्स फाउंडेशन पर आशा द्वारा समर्थित है ।
AGM-EC culture media | |||
Materials for culture of endothelial cells | |||
TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
AGM-EC culture media (500 mls) | |||
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
Materials for AGM index sort | |||
Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
Antibodies for AGM index sort | |||
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
AGM-serum free media (10mls) | |||
X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
Materials for Staining co-cultured cells | |||
96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
Materials for tail vein injection for transplant | |||
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
Equipment | |||
BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo |