인간의 우유 샘플의 타겟된 16S 시퀀싱 하는 방법
Summary
반자동된 워크플로 인간 우유와 다른 낮은 바이오 매스 샘플 종류에서 16S rRNA의 타겟된 시퀀싱에 대 한 제공 됩니다.
Abstract
미생물 커뮤니티 연구는 상대적으로 신속, 저렴 하 고 높은 처리량 시퀀싱의 개발을 광범위 하 게 되었다. 그러나, 이러한 모든 기술에서와 마찬가지로 재현 결과 실험실 워크플로 통합 하는 적절 한 예방 조치 및 컨트롤에 따라 다릅니다. 이것은 특히 낮은 바이오 매스 샘플 중요 어디 세균 DNA 오염 잘못 된 결과 생성할 수 있습니다. 이 문서 낮은-에 중순-throughput 규모에 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 지역의 타겟된 시퀀싱을 사용 하 여 인간 유 방 우유 샘플에서 미생물을 식별 하는 반자동된 워크플로 자세히 설명 합니다. 프로토콜 설명 전체 우유 등에서 샘플 준비: 세포, 핵 산 추출, 증폭, 16S rRNA 유전자 및 품질 관리 조치 라이브러리 준비 V4 영역의 샘플. 프로토콜 및 토론 준비와 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, PCR 반응 억제제 제거, 샘플 오염 환경, 시 약, 포함 하는 낮은 바이오 매스 샘플의 분석을 돌출 하는 문제를 고려 하는 중요 한 것은, 또는 실험 소스, 고 재현성을 보장 하도록 설계 된 실험 모범 사례. 프로토콜을 설명 하는 대로 인간 우유 샘플, 면봉, 깔끔한, 또는 보존 버퍼에 안정 냉동에 수집 된 샘플을 포함 한 수많은 낮은 및 높은 바이오 매스 샘플 종류에 적응은.
Introduction
인간 식민지 미생물 지역 사회는 인간의 건강과 신진 대사, 면역 발달, 질병 민감성과 예방 접종과 약물 치료1, 에 대 한 응답에 영향을 미치는 질병에 매우 중요 한 것으로 2. 현재 인간의 건강에는 microbiota의 영향을 이해 하는 노력 강조 뿐만 아니라 지역화 된 사이트 정의 해부학 구획 (즉, 피부, 창 자, 구두, 등), 관련 된 미생물의 식별 이러한 구획3,4. 이러한 조사 활동을 underpinning 급속 한 출현 및 샘플의 미생물 유전 콘텐츠 (미생물)의 분석에 대 한 대규모 병렬 플랫폼을 제공 하는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 증가 접근성입니다. 많은 생리 샘플, 관련 된 미생물은 복잡 하 고 풍부한 (즉,의 자), 하지만, 일부 샘플은 미생물 어디 낮은 미생물 바이오 매스 (즉, 인간의 우유, 낮은 호흡기)로 표현 됩니다 감도, 실험적인 인공 물, 및 가능한 오염 될 주요 문제. 미생물 연구와 적절 한 실험적인 디자인의 공통 과제 여러 검토 기사5,6,,78의 대상이 되었습니다.
여기에 소개 강력한 NGS 실험 파이프라인 기반으로 rRNA 16S V4 지역9 인간 우유의 미생물 특성의 타겟된 시퀀싱 합니다. 인간 우유의 미생물 분석은 복잡 하지는 본질적으로 낮은 미생물 바이오 매스10여만 하지만 또한 높은 인간 DNA의 레벨11,12,,1314 배경 및 잠재적인 carryover PCR 억제제15,16 추출 된 핵 산의. 이 프로토콜은 상용 추출 키트와 샘플 준비 일괄 처리를 통해 변화를 최소화 하는 것을 도울 수 있는 반자동된 플랫폼에 의존 합니다. 그것은 프로토콜의 각 단계를 확인 하 고 파이프라인 견고성의 독립적인 통계를 제공 하는 품질 관리로 샘플 함께 처리 되는 잘 정의 된 세균성 모의 사회 통합. 로 프로토콜 인간의 우유 샘플에는 설명의 자, 직장, 질, 피부, 나, 그리고 구강 면봉10,17를 포함 하 여 다른 샘플 형식에 쉽게 적응할 수 이며 시작 지점으로 사용할 수 있습니다. 미생물 분석을 수행 하고자 연구원입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA의 타겟된 다음-세대 시퀀싱 미생물 특성화18에 대 한 널리 사용 되 고, 급속 한 기술입니다. 그러나, 일괄 처리 효과, 환경 오염, 샘플 교차 오염을, 감도, 재현성 등 많은 요인 수 부정적인 실험 결과 영향을 하 고 그들의 해석7,19 혼동 , 20. 가장 강력한 16S 분석을 용이 하 게에 미생물 워크플로 좋은 실험 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 프로토콜의 개발에 대 한 Helty Adisetiyo, 박사 Shangxin 양 박사를 감사 하 고 싶습니다. 전반적인 지원에 대 한는 국제 모성 소아 청소년 에이즈 임상 실험 그룹 (IMPAACT) 국립 연구소의 알레르기와 감염 증 (NIAID)의 국립 보건원의 건강 (NIH) 보너스 번호 아래에서 제공한 UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC)와 UM1AI106716 (IMPAACT 액정), 아동 건강과 인간 발달 (NICHD)의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소와 국립 연구소의 정신 건강 (NIMH)에서 공동 자금. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
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