En metode til målrettede 16S sekvensering af modermælk prøver
Summary
En semi-automatiseret arbejdsproces præsenteres for målrettede sekventering af 16S rRNA fra modermælk og andre lav-biomasse prøve typer.
Abstract
Undersøgelser af mikrobielle samfund er blevet udbredt med udviklingen af relativt billig, hurtig og høj overførselshastighed sekvensering. Men som med alle disse teknologier, reproducerbare resultater afhænger en laboratorium arbejdsproces, der omfatter passende forholdsregler og kontrol. Dette er især vigtigt med lav-biomasse prøver, hvor forurener bakteriel DNA kan genererer vildledende resultater. I denne artikel beskrives en semi-automatiseret arbejdsproces til at identificere mikrober fra menneskelige bryst mælkeprøver ved hjælp af målrettede sekventering af 16S ribosomale RNA (rRNA) V4 region på en lav og midten af throughput skala. Protokollen beskriver prøveforberedelse fra sødmælk herunder: prøve lysis, nukleinsyre udvinding, forstærkning af regionen V4 af 16S rRNA gen, og biblioteket forberedelse med foranstaltninger til kvalitetskontrol. Vigtigere, protokol og diskussion overveje spørgsmål, der er iøjnefaldende udarbejdelse og analyse af lav-biomasse prøver herunder passende positive og negative kontroller, PCR hæmmer fjernelse, prøve forurening af miljøet, reagens, eller eksperimentelle kilder, og eksperimenterende bedste praksis skal sikre reproducerbarhed. Mens protokollen som beskrevet er specifikt for humant mælkeprøver, er det kan tilpasses til mange lav – og høj-biomasse prøve typer, herunder prøver, der opsamlet på podninger, frosne pæn eller stabiliseret i en buffer, konservering.
Introduction
De mikrobielle samfund, at kolonisere mennesker menes at være afgørende betydning for menneskers sundhed og sygdom påvirker stofskiftet, immun udvikling, modtagelighed over for sygdom, og svar til vaccination og stofmisbrug behandling1, 2. bestræbelser på at forstå mikrobiota indflydelse på menneskers sundhed i øjeblikket understrege identifikation af mikrober tilknyttet defineret anatomisk rum (dvs., hud, gut, oral, etc.), samt lokaliserede sites inden for disse rum3,4. Understøttelse af disse efterforskningsmæssige indsats er den hurtige fremkomst og øget tilgængelighed af næste generation sequencing (NGS) teknologier, der giver et massivt parallel platform til analyse af de mikrobielle genetiske indhold (microbiome) af en stikprøve. For mange fysiologiske prøver, den tilknyttede microbiome er både komplekse og rigelige (dvs., fæces), men for nogle prøver, microbiome er repræsenteret ved lav mikrobielle biomasse (dvs., modermælk, nedre luftveje) hvor følsomhed, eksperimentelle artefakter og eventuel forurening bliver store spørgsmål. De fælles udfordringer microbiome undersøgelser og relevante eksperimentelle design har været genstand for flere review artikler5,6,7,8.
Præsenteres heri er en robust NGS eksperimentelle pipeline baseret på målrettede sekventering af rRNA 16S V4 region9 at karakterisere microbiome af modermælk. Microbiome analyse af modermælk er kompliceret, ikke kun ved en ifølge sagens natur lav mikrobielle biomasse10, men derudover ved høj niveauer af menneskelig DNA baggrund11,12,13,14 , og potentielle fremførsel af PCR-hæmmere15,16 i uddraget nukleinsyre. Denne protokol er afhængig af kommercielt tilgængelige udvinding kits og semi-automatiske platforme, der kan hjælpe med at minimere variation på tværs af prøven forberedelse partier. Sig indlemmer en veldefineret bakteriel mock Fællesskabets, behandles sideløbende med prøver som en kvalitetskontrol til at validere hvert trin i protokollen og give en uafhængig måling af rørledningen robusthed. Selv om protokollen som beskrevet er specifikke for de menneskelige mælkeprøver, det er let at tilpasse til andre prøve typer herunder taburet, rektal, vaginal, hud, areolar, og mundtlige svaberprøver10,17, og kan tjene som udgangspunkt for forskere, der ønsker at udføre microbiome analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målrettet næste generations sekventering af 16S rRNA er en udbredt, hurtig teknik til microbiome karakterisering18. Men mange faktorer, herunder batch effekter, miljøforurening, prøve krydskontaminering, følsomhed og reproducerbarhed negativt kan påvirke eksperimentelle resultater og forvirre deres fortolkning7,19 , 20. bedst lette robust 16S analyser, microbiome arbejdsprocesser skal indarbejde god…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Helty Adisetiyo, ph.d.- og Shangxin Yang, ph.d. for udviklingen af protokollen. Samlede støtte til den internationale maternel Pediatric Adolescent AIDS kliniske forsøg gruppe (IMPAACT) blev leveret fra National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (NIAID) af National Institutes of Health (NIH) under Award numre UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) og UM1AI106716 (IMPAACT LC), med samfinansiering fra Eunice Kennedy Shriver nationale Institut for børns sundhed og menneskelige udvikling (NICHD) og National Institute of Mental Health (NIMH). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
