Une méthode de séquençage ciblé 16 s d’échantillons de lait maternel
Summary
Un workflow semi-automatisé est présenté pour le séquençage des ARNr 16 s de lait maternel et d’autres types d’échantillons de faible biomasse ciblé.
Abstract
Études des communautés microbiennes sont multipliées avec le développement du séquençage relativement peu coûteux, rapide et haut débit. Cependant, comme avec toutes ces technologies, des résultats reproductibles dépendent un flux de travail de laboratoire qui intègre les contrôles et les précautions d’usage. Ceci est particulièrement important avec des échantillons de faible biomasse où la contamination ADN bactérien peut générer des résultats trompeurs. Cet article décrit un flux de travail semi-automatique pour identifier les microbes des échantillons de lait maternel à l’aide de séquençage ciblé de la région de V4 de l’ARN ribosomique (ARNr) 16 s sur une échelle de faible à moyenne throughput. Le protocole décrit la préparation de l’échantillon de lait entier, y compris : lyse, extraction des acides nucléiques, l’amplification de la région de la V4 du gène ARNr 16 s et préparation de bibliothèque avec des mesures de contrôle de la qualité de l’échantillon. Ce qui est important, le protocole et la discussion tenir compte des questions qui sont importantes pour la préparation et l’analyse des échantillons de faible biomasse, y compris les contrôles positifs et négatifs appropriés, enlèvement d’inhibiteur de la PCR, contamination des échantillons par environnement, réactif, ou sources expérimentales et des pratiques exemplaires expérimentaux visant à garantir la reproductibilité. Le protocole tel que décrit est spécifique aux échantillons de lait maternel, mais il est adaptable à nombreux types d’échantillons de faible et haute-biomasse, y compris les échantillons sur écouvillons, congelés soignée, ou stabilisés dans un tampon de préservation.
Introduction
Les communautés microbiennes qui colonisent les humains sont censées être d’une importance cruciale pour la santé humaine et les maladies qui influencent le métabolisme, développement immunitaire, susceptibilité à la maladie et les réponses à la vaccination et le médicament de thérapie1, 2. efforts pour comprendre l’influence de la microflore sur la santé humaine actuellement mettent l’accent sur l’identification des microbes associés définis compartiments anatomiques(p. ex., peau, intestin, oral, etc.), ainsi que des sites localisés au sein ces compartiments3,4. Ces efforts d’enquête repose sur l’émergence rapide et une plus grande accessibilité des technologies de séquençage de prochaine génération (NGS) qui fournissent une plate-forme massivement parallèle pour l’analyse du contenu génétique microbiens (microbiome) d’un échantillon. Pour beaucoup d’échantillons physiologiques, le microbiome associé est complexe et abondante (c.-à-d., selles), mais, pour certains échantillons, le microbiome est représenté par la biomasse microbienne faible (p. ex., le lait humain, des voies respiratoires inférieures) où sensibilité, objets d’art expérimentales et contamination possible devient grands enjeux. Les défis communs du microbiome études et conception expérimentale appropriée ont fait l’objet de multiples examen articles5,6,7,8.
Présentées ici un pipeline expérimental robuste de NGS repose sur le séquençage ciblé de l’ARNr 16 s V4 région9 pour caractériser le microbiome du lait maternel. Analyse de microbiome du lait maternel n’est pas compliqué que par une faible biomasse microbienne10, mais en plus de haut niveaux d’ADN humain fond11,12,13,14 et report éventuel du PCR inhibiteurs15,16 extrait acide nucléique. Ce protocole repose sur des plateformes semi-automatiques qui peuvent aider à réduire au minimum la variabilité entre les lots de préparation échantillon et de kits d’extraction disponible dans le commerce. Il intègre une communauté simulacre bactérienne bien définie comme un contrôle de la qualité pour valider chaque étape dans le protocole et fournir une métrique indépendante de la robustesse du pipeline de traitement aux côtés d’échantillons. Bien que le protocole comme décrit est spécifique pour les échantillons de lait maternel, il est facilement adaptable à d’autres types d’échantillon dont les selles, rectale, vaginale, peau, écouvillons aréolaires et orale10,17et peut servir de point de départ pour chercheurs qui souhaitent effectuer des analyses sur le microbiome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ciblée génération séquençage des ARNr 16 s est une technique largement utilisée, rapide pour microbiome caractérisation18. Cependant, de nombreux facteurs, y compris les effets du traitement par lots, contamination de l’environnement, cross-contamination des échantillons, sensibilité et reproductibilité peuvent nuire résultats expérimentaux et confondre leur interprétation7,19 , 20. pour mi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Helty Adisetiyo, Ph.d et Shangxin Yang, Ph.d pour l’élaboration du protocole. Soutien global pour l’International maternelle pédiatrique Adolescent sida clinique essais Group (IMPAACT) a été fourni par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) des National Institutes of Health (NIH) sous les numéros de prix UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) et UM1AI106716 (IMPAACT LC), avec un cofinancement de la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) et le National Institute of Mental Health (NIMH). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
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