Eine Methode zur gezielten 16 s Sequenzierung des menschlichen Milchproben
Summary
Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.
Abstract
Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low – mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low – und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.
Introduction
Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,4. Diese investigativen Bemühungen ist die rasche Entstehung und erhöhte Zugänglichkeit der Next Generation Sequencing (NGS) Technologien, die eine massiv parallele Plattform zur Analyse der mikrobiellen genetischen Inhalte (Mikrobiom) einer Probe. Für viele physiologische Proben, die damit verbundenen Microbiome ist komplex und reichlich (d.h., Hocker), aber für einige Proben ist das Mikrobiom durch geringe mikrobielle Biomasse (d.h., Muttermilch und unteren Atemwege) vertreten, wo Empfindlichkeit, experimentellen Artefakte und mögliche Verunreinigungen werden wichtige Themen. Die gemeinsamen Herausforderungen der Microbiome Studien und geeignete Versuchsanordnung wurden mehrere Review Artikel5,6,7,8.
Enthaltenen basiert eine robuste NGS experimentelle Pipeline auf gezielte Sequenzierung der rRNA 16 s V4 Region9 Mikrobiom der Muttermilch zu charakterisieren. Microbiome Analyse der menschlichen Milch ist kompliziert, nicht nur durch eine von Natur aus geringe mikrobielle Biomasse-10, sondern zusätzlich durch hohe Niveaus der menschlichen DNA Hintergrund11,12,13,14 und mögliche Übertragung von PCR-Inhibitoren15,16 in extrahierten Nukleinsäuren. Dieses Protokoll setzt auf handelsübliche Extraktion Kits und semi-automatischen Plattformen, die helfen können Variabilität auf Probe Vorbereitung Chargen zu minimieren. Es enthält eine wohldefinierte mock Bakteriengemeinschaft, die neben Proben verarbeitet wird, als eine Qualitätskontrolle überprüfen jeden Schritt im Protokoll und bieten eine unabhängige Metrik der Pipeline Robustheit. Obwohl das Protokoll als beschrieben für die Muttermilch Proben handelt, es ist leicht anpassbar an andere Probentypen wie Hocker, rektale und vaginale, Haut, areolar und mündliche Tupfer10,17, und dient als Ausgangspunkt für Forscher, die Microbiome Analysen durchführen möchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu er…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
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