En metode for målrettet 16S sekvensering av morsmelk prøver
Summary
En semi-automatisert arbeidsflyt er presentert for målrettet sekvensering av 16S rRNA fra morsmelk og andre lav-biomasse prøven.
Abstract
Studier av mikrobielle samfunn har blitt utbredt med utviklingen av relativt billig, rask og høy gjennomstrømning sekvensering. Men som med alle disse teknologiene, avhenger reproduserbare resultatene en laboratorium arbeidsflyt som inkorporerer forsiktighetsregler og kontroller. Dette er spesielt viktig med lav biomasse eksempler der forurensende bakteriell DNA kan generere misvisende resultater. Denne artikkelen omhandler en semi-automatisert arbeidsflyt for å identifisere mikrober fra menneskelig bryst melk prøver med målrettet sekvensering av regionen 16S ribosomal RNA (rRNA) V4 på en lav og middels throughput skala. Protokollen beskriver eksempel forberedelse helmelk inkluderer: sample lysis, nukleinsyre utvinning, forsterkning av regionen V4 16S rRNA genet og biblioteket forberedelser med kvalitet kontrolltiltak. Viktigere, protokollen og diskusjon vurdere problemer som er fremtredende til forberedelse og analyse av lav-biomasse prøver inkludert aktuelle positive og negative kontroller, PCR hemmer fjerning, prøve forurensning av miljømessige, reagens, eller eksperimentell kilder og eksperimentelle rutiner for å sikre reproduserbarhet. Mens som er spesifikke for morsmelk prøver er det tilpasses mange lav og høy biomasse eksempel typer, inkludert samlet på vattpinner, frosset ryddig eller stabilisert i en bevaring buffer.
Introduction
De mikrobielle samfunnene som kolonisere mennesker antas å være kritisk viktig for menneskers helse og sykdom som påvirker metabolismen, immun utvikling, mottakelighet for sykdom, og svar til vaksinasjon og stoffet terapi1, 2. innsats for å forstå innflytelsen av bakterieflora på helse nå understreke identifikasjon av mikrober forbundet med definerte anatomiske rom (dvs., hud, gut, muntlig, etc.), samt lokaliserte områder innenfor rom3,4. Underbygger dette undersøkende arbeidet er rask fremveksten og økt tilgjengelighet av neste generasjons sekvensering (NGS) teknologier som gir et massivt parallelle plattform for analyse av mikrobiell genetisk innholdet (microbiome) av en prøve. For mange fysiologiske prøver, den tilknyttede microbiome er både komplisert og rikelig (dvs., avføring), men for noen prøver, microbiome er representert ved lav mikrobiell biomasse (dvs., morsmelk, nedre luftveier) der følsomhet, eksperimentelle gjenstander og mulig smitte bli store problemer. Felles utfordringer microbiome studier og riktig eksperimentell design har vært gjenstand for flere gjennomgang artikkel5,6,7,8.
Presenteres her er en robust NGS eksperimentelle rørledning basert på målrettet sekvensering av rRNA 16S V4 regionen9 å karakterisere microbiome for human melk. Microbiome analyse av morsmelk er komplisert ikke bare som en iboende lav mikrobiell biomasse10, men i tillegg av høye nivåer av menneskelig DNA bakgrunn11,12,13,14 og potensielle carryover PCR hemmere15,16 i utdraget nukleinsyre. Denne protokollen er avhengig av kommersielt tilgjengelig utvinning kits og semi-automatisert plattformer som reduserer variasjon over eksempel forberedelse bunker. Det har et veldefinert bakteriell narr samfunn som behandles sammen med eksempler som en kvalitet kontroll å validere hvert trinn i protokollen og gi en selvstendig beregning av rørledningen robusthet. Selv om protokollen som beskrevet er spesifikke for morsmelk prøvene, det er lett tilpasses andre eksempel typer inkludert avføring, rektal, vaginal, hud, areolar og muntlig vattpinner10,17, og kan tjene som et utgangspunkt for forskere som ønsker å utføre microbiome analyserer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målrettet neste generasjons sekvensering av 16S rRNA er en mye brukt, rask teknikk for microbiome karakterisering18. Men kan mange faktorer, inkludert satsvise effekter, miljøforurensning, prøve kryssforurensning, følsomhet og reproduserbarhet negativt påvirke eksperimentelle resultater og forvirre deres tolkning7,19 , 20. til beste rette robust 16S analyser, microbiome arbeidsflyter må innarbeide g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Helty Adisetiyo, PhD og Shangxin Yang, PhD for utvikling av protokollen. Generell støtte for internasjonale mors Pediatric ungdom AIDS kliniske forsøk gruppe (IMPAACT) ble gitt av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) av den National Institutes of Health (NIH) under prisen tall UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) og UM1AI106716 (IMPAACT lb), med co-finansiering fra Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) og National Institute of Mental Health (NIMH). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
