Um método para o sequenciamento de alvo 16S das amostras de leite humano
Summary
Um fluxo de trabalho semi-automático é apresentado para sequenciamento alvo de 16S rRNA de leite humano e outros tipos de amostras de biomassa de baixo.
Abstract
Estudos de comunidades microbianas tornaram-se generalizados com o desenvolvimento do sequenciamento de relativamente barata, rápida e alta taxa de transferência. No entanto, como com todas estas tecnologias, resultados reprodutíveis dependem de um fluxo de trabalho de laboratório que incorpora controles e as devidas precauções. Isto é particularmente importante com amostras de baixa biomassa onde a contaminação bacteriana DNA pode gerar resultados enganosos. Este artigo detalha um fluxo de trabalho semi-automático para identificar micróbios de amostras de leite materno usando alvo sequenciamento da região 16S RNA ribossomal (rRNA) V4 em escala para baixo e médio throughput. O protocolo descreve a preparação da amostra de leite integral incluindo: Lise, extração de ácidos nucleicos, amplificação da região V4 do gene de rRNA 16S e preparação de biblioteca com as medidas de controlo de qualidade da amostra. Importante, o protocolo e discussão consideram questões que são importantes para a preparação e análise de amostras de baixa-biomassa, incluindo controlos adequados em positivos e negativos, remoção de inibidor PCR, contaminação da amostra por ambiental, reagente, ou fontes experimentais e práticas recomendadas experimentais concebidas para garantir a reprodutibilidade. Enquanto o protocolo como descrito é específico para as amostras de leite humano, é adaptável a vários tipos de amostra de baixa e alta-biomassa, incluindo amostras coletadas em cotonetes, congelados puro, ou estabilizado em um buffer de preservação.
Introduction
As comunidades microbianas que colonizam os seres humanos são acreditadas para ser criticamente importante para a saúde humana e doença influenciam o metabolismo, desenvolvimento imune, susceptibilidade a doenças e respostas a vacinação e drogas terapia1, 2. esforços para entender a influência da microbiota na saúde humana atualmente enfatizam a identificação de micróbios associados com compartimentos anatômicos definidos (i.e., pele, intestino, oral, etc.), bem como sites localizados dentro Estes compartimentos3,4. Subjacente a esses esforços de investigação é o rápido aparecimento e maior acessibilidade das tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) que fornecem uma plataforma maciçamente paralelo para análise do conteúdo genético microbiano (microbiome) de uma amostra. Para muitas amostras fisiológicas, o associado microbiome é complexa e abundante (i.e., fezes), mas, para algumas amostras, a microbiome é representada por baixo carbono da biomassa microbiano (ou seja, leite humano, trato respiratório inferior) onde sensibilidade, artefatos experimentais e possível contaminação tornam-se grandes questões. Os desafios comuns de microbiome estudos e delineamento experimental adequado tem sido objecto de múltiplas revisão artigos5,6,7,8.
Aqui apresentados um robusto pipeline experimental de NGS baseia-alvo sequenciamento do rRNA 16S V4 região9 para caracterizar a microbiome do leite humano. Microbiome análise do leite humano é complicado, não só por uma biomassa microbiana inerentemente baixa10, mas adicionalmente por alto níveis de DNA humano fundo11,12,13,14 e potencial Reportes de PCR inibidores15,16 em extraído do ácido nucleico. Este protocolo baseia-se nas plataformas semi automatizadas que podem ajudar a minimizar a variabilidade entre lotes de preparação de amostra e kits de extração comercialmente disponível. Incorpora uma comunidade simulada bacteriana bem definida é processado juntamente com amostras como um controle de qualidade para validar cada passo no protocolo e fornecem uma métrica independente da robustez do gasoduto. Embora o protocolo como descrito é específico para as amostras de leite humano, é facilmente adaptável para outros tipos de amostras, incluindo fezes, retal, vaginal, pele, cotonetes areolar e oral10,17e pode servir como ponto de partida para pesquisadores que desejem realizar análises microbiome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sequenciamento de próxima geração alvo de 16S rRNA é uma técnica amplamente utilizada, rápida para microbiome caracterização18. No entanto, muitos fatores, incluindo efeitos de lote, contaminação ambiental, contaminação cruzada amostra, sensibilidade e reprodutibilidade podem adversamente afetar resultados experimentais e confundir sua interpretação7,19 , 20. para melhor facilitar análises …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Helty Adisetiyo, PhD e Shangxin Yang, PhD para o desenvolvimento do protocolo. Suporte total para o internacional materna pediátrica adolescente AIDS clínicos ensaios grupo (IMPAACT) foi fornecido pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) do National Institutes of Health (NIH) sob os números do prêmio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) e UM1AI106716 (LC IMPAACT), com o co-financiamento do Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) e o Instituto Nacional de Saúde Mental (NIMH). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
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