En metod för riktade 16S sekvensering av bröstmjölk prover
Summary
För riktade sekvensering av 16S rRNA från modersmjölk och andra typer av låg-biomassa prov presenteras ett halvautomatiskt arbetsflöde.
Abstract
Studier av mikrobiella samhällen har blivit vanligt med utvecklingen av relativt billig, snabb och hög genomströmning sekvensering. Men som med alla dessa tekniker, beror reproducerbara resultat på ett laboratorium arbetsflöde som innehåller lämpliga försiktighetsåtgärder och kontroller. Detta är särskilt viktigt med låg-biomassa prover där kontaminerande bakteriell DNA kan generera missvisande resultat. Den här artikeln beskriver en halvautomatisk arbetsflödet för att identifiera mikrober från bröstmjölk mjölkprover med riktade sekvensering av 16S ribosomalt RNA (rRNA) V4 regionen på en låg – till mitten av – throughput skala. Protokollet beskrivs provberedning från helmjölk inklusive: prov lysis, nukleinsyra utvinning, förstärkning av regionen V4 av 16S rRNA-genen, och biblioteket förberedelser med åtgärder för kvalitetskontroll. Ännu viktigare, protokoll och diskussion överväga frågor som är framträdande för förberedelserna och analysen av låg-biomassa prover inklusive lämpliga positiva och negativa kontroller, PCR-hämmare borttagning, prov kontaminering av miljön, reagens, eller experimentell källor och experimentella bästa praxis för att säkerställa reproducerbarhet. Protokollet som beskrivs är specifika för bröstmjölk prover, är det anpassningsbar till ett flertal typer av låg – och hög-biomassa prov, inklusive prover som tagits på bomullstops, fryst snyggt, eller stabiliserad i en bevarande buffert.
Introduction
De mikrobiella samhällen att kolonisera människor tros vara kritiskt viktigt för människors hälsa och sjukdom som påverkar metabolismen, immun utveckling, känslighet för sjukdomar, och Svaren till vaccination och drogen terapi1, 2. insatser för att förstå bakterieflora inverkan på människors hälsa för närvarande betona identifiering av mikrober som är associerad med definierade anatomiska fack (dvs, hud, tarm, oralt, etc.), samt lokaliserade platser inom dessa fack3,4. Som underbygger dessa utredningsinsatser är den snabba uppkomsten och ökad tillgänglighet av nästa generations sekvensering (NGS) teknik som ger ett massivt parallella plattform för analys av mikrobiella genetiska innehållet (microbiom) ett varuprov. För många fysiologiska prover, de associerade mikrobiomet är både komplex och riklig (dvs, avföring), men, för vissa prover i mikrobiomet representeras av låg mikrobiella biomassan (dvs, bröstmjölk, nedre luftvägarna) där känslighet, experimentell artefakter och eventuell förorening blivit viktiga frågor. De gemensamma utmaningarna som mikrobiomet studier och lämplig experimentell design har varit föremål för flera granskning artiklarna5,6,7,8.
Presenteras häri är en robust NGS experimentella pipeline baserat på riktade sekvensering av rRNA 16S V4 region9 att karakterisera mikrobiomet av bröstmjölk. Mikrobiomet analys av bröstmjölk är komplicerade inte endast av en inneboende låg mikrobiella biomassan10, men dessutom av höga nivåer av mänskligt DNA bakgrund11,12,13,14 och potentiell överföring av PCR-hämmare15,16 i extraherade nukleinsyra. Protokollet bygger på kommersiellt tillgängliga utvinning Kit och halvautomatisk plattformar som kan hjälpa till att minimera variabiliteten över prov förberedelse batchar. Den inlemmar en väldefinierad bakteriell håna gemenskap som bearbetas tillsammans med prover som en kvalitetskontroll för att verifiera varje steg i protokollet och ge en oberoende metriska av rörledning robusthet. Även om protokollet som beskrivs är specifika för de bröstmjölk proverna, det är lätt att anpassa till andra provtyper inklusive pall, rektal, vaginalt, hud, areolar och muntliga kompresser10,17, och kan fungera som en utgångspunkt för forskare som vill utföra mikrobiomet analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riktade nästa generations sekvensering av 16S rRNA är en allmänt använd, snabb teknik för mikrobiomet karakterisering18. Men kan många faktorer, inklusive batch effekter, miljöförorening, prov korskontaminering, känslighet och reproducerbarhet negativt påverka försöksresultaten och blanda ihop sin tolkning7,19 , 20. för att underlätta bäst robust 16S analyser, mikrobiomet arbetsflöden mås…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Helty Adisetiyo, PhD och Shangxin Yang, PhD för utveckling av protokollet. Övergripande stöd för den internationella mödra Pediatric Adolescent AIDS kliniska prövningar Group (IMPAACT) tillhandahölls av det nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) av National Institutes of Health (NIH) under Award nummer UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) och UM1AI106716 (IMPAACT LC), med medfinansiering från Eunice Kennedy Shriver nationella institutet för barns hälsa och mänskliga utvecklingen (NICHD) och National Institute of Mental Health (NIMH). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NIH.
Materials
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction kit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA decontaminant |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | temperature-controlled vortexer | |
| Buffer RLT plus | Qiagen | 1053393 | guanidinium thiocyanate lysis buffer/ Part of Allprep kit |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME is a reducing agent that will irreversibly denature RNases by reducing disulfide bonds |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | bead tube |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automated sample disruptor adapter set |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB tube | manufacturer's microcentrifuge tube in kit | ||
| QIAcube and related plasticware | Qiagen | 9001292 | automated DNA/RNA purification instrument |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | non-enzymatic decontamination solution |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | elution buffer |
| QIAgility and related plasticware | Qiagen | 9001532 | robotic liquid handler |
| PCR water | MO BIO | 17000- | |
| 5PRIME HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcoded reverse primers | Eurofin | No Catalog #'s | designed and ordered |
| 96 well PCR plate | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 and related plasticware | Agilent | G2964AA | automated DNA/RNA fragment analyzer |
| D1000 reagents for Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Sample buffer and ladder are part of this kit |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR inhibitor removal is done per the manufacturer's instructions. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up kit: silica-membrane-based purification of PCR products |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | dimethylsulfoxide-based dilution buffer and dye are part of this kit. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | microvolume spectrophotometer | |
| MiSeq 300 V2 kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | next generation sequencer |
Referências
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolites Affect Human Health and Shape the Immune System. Cell Metab. , (2017).
- Hall, M. W., et al. Inter-personal diversity and temporal dynamics of dental, tongue, and salivary microbiota in the healthy oral cavity. NPJ Biofilms Microbiomes. 3, 2 (2017).
- Perez Perez, G. I., et al. Body Site Is a More Determinant Factor than Human Population Diversity in the Healthy Skin Microbiome. PLoS One. 11 (4), e0151990 (2016).
- Hamady, M., Knight, R. Microbial community profiling for human microbiome projects: Tools, techniques, and challenges. Genome Res. 19 (7), 1141-1152 (2009).
- Human Microbiome Project, C. A framework for human microbiome research. Nature. 486 (7402), 215-221 (2012).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Front Microbiol. 8, 1561 (2017).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
- Pannaraj, P. S., et al. Association Between Breast Milk Bacterial Communities and Establishment and Development of the Infant Gut Microbiome. JAMA Pediatr. , (2017).
- Ho, F. C., Wong, R. L., Lawton, J. W. Human colostral and breast milk cells. A light and electron microscopic study. Acta Paediatr Scand. 68 (3), 389-396 (1979).
- Parmely, M. J., Beer, A. E., Billingham, R. E. In vitro studies on the T-lymphocyte population of human milk. J Exp Med. 144 (2), 358-370 (1976).
- Sabbaj, S., et al. Human immunodeficiency virus-specific CD8(+) T cells in human breast milk. J Virol. 76 (15), 7365-7373 (2002).
- Jimenez, E., et al. Metagenomic Analysis of Milk of Healthy and Mastitis-Suffering Women. J Hum Lact. 31 (3), 406-415 (2015).
- Ghosh, M. K., et al. Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 in breast milk. J Clin Microbiol. 41 (6), 2465-2470 (2003).
- Lim, N. Y., Roco, C. A., Frostegard, A. Transparent DNA/RNA Co-extraction Workflow Protocol Suitable for Inhibitor-Rich Environmental Samples That Focuses on Complete DNA Removal for Transcriptomic Analyses. Front Microbiol. 7, 1588 (2016).
- Bender, J. M., et al. Maternal HIV infection influences the microbiome of HIV-uninfected infants. Sci Transl Med. 8 (349), 349ra100 (2016).
- Cox, M. J., Cookson, W. O., Moffatt, M. F. Sequencing the human microbiome in health and disease. Hum Mol Genet. 22 (R1), R88-R94 (2013).
- Lauder, A. P., et al. Comparison of placenta samples with contamination controls does not provide evidence for a distinct placenta microbiota. Microbiome. 4 (1), 29 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
- Walker, A. W., et al. 16S rRNA gene-based profiling of the human infant gut microbiota is strongly influenced by sample processing and PCR primer choice. Microbiome. 3, 26 (2015).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathog. 8, 24 (2016).
- Kennedy, K., Hall, M. W., Lynch, M. D., Moreno-Hagelsieb, G., Neufeld, J. D. Evaluating bias of illumina-based bacterial 16S rRNA gene profiles. Appl Environ Microbiol. 80 (18), 5717-5722 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
- Aho, V. T., et al. The microbiome of the human lower airways: a next generation sequencing perspective. World Allergy Organ J. 8 (1), 23 (2015).
- Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am J Respir Crit Care Med. 184 (8), 957-963 (2011).
- Bittinger, K., et al. Improved characterization of medically relevant fungi in the human respiratory tract using next-generation sequencing. Genome Biol. 15 (10), 487 (2014).
- Jervis-Bardy, J., et al. Deriving accurate microbiota profiles from human samples with low bacterial content through post-sequencing processing of Illumina MiSeq data. Microbiome. 3, 19 (2015).
- Knights, D., et al. Bayesian community-wide culture-independent microbial source tracking. Nat Methods. 8 (9), 761-763 (2011).
- Lazarevic, V., Gaia, N., Girard, M., Schrenzel, J. Decontamination of 16S rRNA gene amplicon sequence datasets based on bacterial load assessment by qPCR. BMC Microbiol. 16, 73 (2016).
- Kurilshikov, A., Wijmenga, C., Fu, J., Zhernakova, A. Host Genetics and Gut Microbiome: Challenges and Perspectives. Trends Immunol. 38 (9), 633-647 (2017).
- . Mock microbial communities Available from: https://www.atcc.org/en/Products/Microbiome_Standards.aspx?utm_id=t170601524l1 (2017)
