Samtidig mätning av superoxid-och/eller väteperoxid och NADH produktion av Flavin-innehållande mitokondriell mellan östradiol och östron
Summary
Mitokondrierna innehåller flera flavin-beroende enzymer som kan producera reaktiva syreradikaler (ROS). Övervakning ROS är release från enskilda platser i mitokondrier utmanande på grund av oönskade sidoreaktioner. Vi presenterar en enkel och billig metod för direkt bedömning av inhemska priser för ROS release med hjälp av renat flavoenzymes och mikroplattan fluorometry.
Abstract
Det har rapporterats att mitokondrier kan innehålla upp till 12 enzymatisk källor av reaktiva syreradikaler (ROS). En majoritet av dessa platser inkluderar flavin-beroende respiratoriska komplexen och mellan östradiol och östron som producerar en blandning av superoxid (O2● –) och väteperoxid (H2O2). Exakt kvantifiering av ROS-producerande potentialen hos enskilda platser i isolerade mitokondrier kan vara utmanande på grund av förekomsten av antioxidant försvarssystem och sidoreaktioner som också bildar O2● –h2O2. Användning av ospecifik hämmare som kan störa mitokondriell blockeringar kan också äventyra mätningar genom att ändra ROS release från andra platser i produktion. Här presenterar vi en enkel metod för samtidig mätning av H2O2 release och nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) produktion av renat flavin-kopplad mellan östradiol och östron. För våra syften här, har vi använt renat pyruvat dehydrogenas komplexet (PDHC) och α-ketoglutarat dehydrogenas komplexa (KGDHC) av svin hjärtat ursprung som exempel. Denna metod möjliggör en korrekt bild av infödda H2O2 release priser av enskilda platser av produktionen genom att eliminera andra potentiella källor av ROS och antioxidativa system. Denna metod möjliggör dessutom en direkt jämförelse av förhållandet mellan H2O2 release och enzymaktivitet och screening av effektiviteten och selektivitet av hämmare för ROS produktion. Sammantaget kan detta tillvägagångssätt för fördjupad bedömning av inhemska priser av ROS release för enskilda enzymer före genomföra mer sofistikerade experiment med isolerade mitokondrier eller permeabilized muskelfiber.
Introduction
Det yttersta målet för näringsämnen metabolism är att göra omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP). I däggdjursceller sker detta i mitokondrierna, dubbel-membraned organeller som omvandlar den energi som lagras i kol till ATP. Produktionen av ATP börjar när kol förbränns av mitokondrier bildar två elektron bärare, NADH och flavin-adenin-dinukleotid (Fransson2)1. NADH och Forslund2 sedan oxideras av flera subenhet respiratoriska komplexen I och II, respektive, och de frigjorda elektronerna är flottade till terminal elektron acceptorn molekylära syret (O2) komplex IV1. Thermodynamically gynnsamma ”neråt” överföring av elektroner till O2 i slutet av kedjan är kopplat till export av protoner i intermembrane utrymme av komplex I, III och IV. Detta skapar en transmembrana elektrokemiska gradient av protoner (proton-drivkraft), en tillfällig form av Gibbs fria energi som tappas av komplex V att göra ATP2. Electron överföring reaktioner i mitokondrier är inte perfekt kopplat till ATP produktionen. På olika punkter i Krebs cykel och respiratoriska kedjan, kan elektroner förtidigt interagera med O2 till blankett ROS3. De mest biologiskt relevanta ROS som genereras av mitokondrierna är O2●- och H2O2. Även om O2● – anses ofta vara den proximala ROS som bildas av mitokondrier, är det nu uppenbart att platser av produktionen utgör en blandning av O2●- och H2O2, som är associerad med den fria radikalkemi av flavin prostetiska grupper4,5. Vid höga nivåer, kan ROS vara farligt, skada biologiska beståndsdelar som behövs för cellernas funktion som leder till oxidativ stress6. Men på låga belopp uppfylla mitokondriell ROS vitala signalering funktioner. Exempelvis har H2O2 release från mitokondrier varit inblandade i styrning av T-cells aktivering, stress signalering (t.ex., induktion av Nrf2 signalvägar), induktion av cellproliferation och differentiering, insulin signalering och release, och utfodring beteende7. Avsevärda framsteg har gjorts för att förstå funktionen signalering av ROS. Dock viktiga frågor fortfarande för vilka enzymer i mitokondrierna fungerar som de viktigaste källorna och hur produktionen kontrolleras.
ROS release av en webbplats av produktionen beror på flera faktorer: 1) koncentrationen av den elektron att donera site, 2) redox delstaten electron att skänka platsen, (3) tillgång till syre, och (4) den koncentration och typ av oxidation substrat3, 8 , 9. i mitokondrierna, andra faktorer som koncentrationen av NADH och membran potentiella styrka också påverka ROS produktion8,10. Till exempel, ökar O2● –h2O2 produktionstakten av renat PDHC eller KGDHC med ökande NADH tillgänglighet5,11. I det här fallet flödar elektroner bakåt från NADH till FAD center i den E3 subuniten av PDHC eller KGDHC, webbplatsen för O2● –h2O2 produktion12. Likaså har tillhandahållande av NAD+ motsatt effekt, minskar ROS release från KGDHC12. Således, kontrollerande inresa eller utresa av elektroner från platser av ROS produktion kan ändra hur mycket O2● –h2O2 bildas. Till exempel blockerar den E2 subuniten av PDHC eller KGDHC med CPI-613, en analog, resulterar i en nästan 90% minskning av O2● –h2O2 produktion13liponsyra. Liknande resultat kan erhållas med kemiska S-glutathionylation katalysatorer, diamide och disulfiram, som nästan avskaffa O2● –h2O2 produktion av PDHC eller KGDHC via konjugationen av glutation till E 2 subenhet14. Avvägningen för att blockera elektronflödet genom den E2 subuniten av PDHC och KGDHC är en minskning av NADH produktion vilket minskar ROS bildandet av elektron transportkedjan (t.ex., komplex III). Detta kan också minska ATP produktionen av elektron transportkedjan. Sammantaget kan blockerar elektron inträde till platser av ROS produktion vara ett mycket effektivt sätt att styra O2● –h2O2 produktion.
Mitokondrier kan innehålla upp till 12 potentiella O2● –h2O2 källor6. De flesta av dessa platser är flavin-innehållande enzymer som skapar en blandning av O2●- och H2O2. Användningen av olika substrat och hämmare kombinationer har tillåtet för identifiering som respiratoriska komplexen och mitokondrie mellan östradiol och östron fungera somhög kapacitet O2● –h2O2 bildar platser i olika vävnader3. PDHC och KGDHC har visat sig fungera som hög kapacitet O2● –h2O2 utsändande platser i muskel och lever mitokondrier13,15. Vissa svårigheter kvarstår dock när det gäller undersökningen av O2● –h2O2 utgör potentiella av enskilda webbplatser i mitokondrierna och inverkan som olika substrat och hämmare kombinationer har på verksamheten i enzymerna. Detta på grund av förekomsten av oönskade sidoreaktioner (t.ex., bildandet av O2● –h2O2 av webbplatser än enzymet av intresse), kontaminerande kroppsegna näringsämnen (t.ex.,fettsyror syror) eller organeller (t.ex., peroxisomes som också bildar O2● –h2O2), och användning av hämmare som saknar selektivitet eller användning av föreningar som inte hämmar fullt ROS produktion. Vissa hämmare kan också förändra mitokondriell Bioenergetik och elektron flödesriktning, och detta förändrar ROS release från andra platser i produktion och förvirrar resultat. Absoluta priser för O2●h2O2 frisättning från enskilda platser i mitokondrier är också svåra att kvantifiera på grund av den höga koncentrationen av O2●- och H2O2 eliminera enzymer i matrix och intermembrane rum. Därför, eliminering av eventuella konkurrerande reaktioner som kan störaO2● –h2O2 release mätningar kan vara användbart vid identifiering av hög kapacitet O2● –h2O2 bildar platser.
Här presenterar vi en enkel metod som möjliggör samtidig undersökning av O2● –h2O2 produktion och NADH bildandet av renat flavin-beroende mellan östradiol och östron. Genom att använda renat enzymer, kan oönskade ROS bildar sidoreaktioner och ROS förnedrande enzymer elimineras möjliggör ett mer exakt mått på infödda O2● –h2O2 produktion priser för enskilda flavoenzymes. Denna metod kan användas för att direkt jämföra O2● –h2O2 bildar kapaciteten av olika renat mellan östradiol och östron eller till skärmen potentiella platsspecifika hämmare för O2● –h2O 2 release. Slutligen, mäta O2● –h2O2 och NADH produktion samtidigt kan medge en realtid bedömning av förhållandet mellan enzymaktivitet och ROS release kapacitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll är fördelaktigt eftersom, 1) den eliminerar eventuella konkurrerande reaktioner som kan annars störa H2O2 identifiering (t.ex., antioxidant system eller andra källor av ROS), 2) ger en direkt bedömning av den infödda ROS release av en flavin-innehållande mitokondriell dehydrogenas, 3) tillåter jämförelse av infödingen ROS release priser av två eller mer renad flavin-baserade mellan östradiol och östron, 4) kan tillåta för en direkt jämförelse av ROS release…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC). Videoproduktion genomfördes i samarbete med centrum för Innovation inom undervisning och lärande (oberoende Transaktionsförteckning) på Memorial universitet av Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
Referências
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
