Vivo에서 토끼 일반적인 경 동맥 내 피에 유전자 이동

Summary

이 메서드는 transgene 토끼 경 동맥의 내 피에 소개 하는. 소개는 transgene의 transgene 제품 정상적인 동맥 또는 질병 모델에서의 생물학적 역할의 평가 허용 한다. 방법은은 DNA 규제 시퀀스의 활동을 측정 하기 위한도 유용 합니다.

Abstract

이 방법의 목표는 고립 된 세그먼트 두 토끼 일반적인 경 동맥의 내 피에는 transgene를 소개 하는 것입니다. 방법 초점 내 피 선택 transgenesis, 내 피 표현 transgenes의 생물학적 역할을 결정 하 고 큰 동맥에서 DNA 시퀀스의 vivo에서 transcriptional 활동 척도를 조사 함으로써 달성 내 피 세포입니다. 메서드를 사용 하면 토끼 일반적인 경 동맥과 한 arteriotomy의 외과 격리를 사용 하 여 동맥 루멘으로 transgene 표현 바이러스 성 벡터를 제공. 루멘 내용의 후속 포부와 함께 루멘에 벡터의 짧은 잠복기 감지 변환 또는 외부의 식 피에 transgene의 효율적이 고 내구성이 식 달성 하기 충분 하다는 격리 된 동맥 세그먼트입니다. 메서드를 수 있습니다 transgene 제품의 생물 학적 활동의 평가 정상적인 동맥와 인간의 혈관 질환의 모델에 다른 사이트 (예유전자 납품을 대상으로 하 여 발생할 수 있는 조직의 효과 피하는 동안. 간) 또는 세균 선 transgenesis에 의해 유전 구조는 피를 전달 하는 대체 접근 방식에 의해. 방법의 응용 프로그램은 숙련 된 외과 의사와 빡빡한, 시설을 잘 갖춘된 수술 실, 구매 하 고 주택 토끼의 비용에 대 한 필요 성과 전문성 유전자 전달 벡터 건설 및 사용에 대 한 필요에 의해 제한 됩니다. 이 방법으로 얻은 결과 포함: transgene 관련 변경 동맥 구조, cellularity, 기질, 또는 조절과 기능; 증가 또는 감소 동맥 염증; 혈관 세포 apoptosis; 변경 그리고 진행, 지체, 또는 내 증식 또는 동맥 경화와 같은 질병의 회귀. 메서드를 또한 수 있습니다 transgene 식 내 피 세포에 제공 하는 포함 하는 결과 변경 하는 네이티브 및 합성 DNA 규제 시퀀스의 능력의 측정: transgene의 레벨 mRNA, transgene 단백질의 수준과 transgene의 수준 효소 활동입니다.

Introduction

이 방법의 목표는 토끼 일반적인 경 동맥의 내 피에는 transgene를 소개 하는 것입니다. 소개는 transgene의 정상적인 동맥와 인간의 동맥 질병의 토끼 모델에서 transgene 제품의 생물 학적 역할의 평가 허용 한다. 질병 모델에서 transgene의 overexpression는 transgene (및 그것의 단백질 제품) 치료제^1,,,234로 약속을 표시 하는지 여부를 알아낼 수 있습니다. Cis-행동 규제 요소 transgene 식 카세트 포함^5,6 vivo에서동맥 내 피에에서 이러한 요소의 활동의 평가 수 있습니다. 요소의 특정 cis 연기는 규제 활동의 지식은 더 액티브 식 카세트를 디자인 하 고 큰 동맥 내 피 vivo에서⁷에서 유전자 규칙의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

토끼는 인간의 혈관 생리학 및 질병의 다양 한 측면에 대 한 귀중 한 모델입니다. 토끼는 인간과 많은 혈관 기능을 공유. 예를 들어 초기 계획 혈액 값, hemostatic, 규정과 혈관 경도 긴장 토끼와 인간⁸사이 비슷합니다. 혈관 질환의 토끼 모델 복제 등 많은 인간 질병의 주요 특징: 동맥 류 (비슷한 형상 및 흐름 특성)⁹, vasospasm (혈관 내 수술 치료에 유사한 반응)^10,11, 그리고 아 테 롬 (내 플 라크 섬유 모자에 풍부한 지질, 대 식 세포, 평활 근 세포에서 코어를 포함 한 비슷한 기능)^12,13. 따라서, 토끼 모델 혈전 증, vasospasm, 동맥 류, 당뇨병, 혈관 이식 편 협 착 증, 동맥 경화^8,,1314, 등 많은 혈관 질환에 대 한 개발 되었습니다 ^15,16.

연구자의 혈관 생리학과 질병 동물 모델 중 선택, 토끼는 몇 가지 장점이 있습니다. 설치류에 비해, 토끼의 큰 혈관 쉽게 수술 조작, 혈관 내 수술 장치의 사용 및 정량적 측정에 대 한 조직의 더 큰 금액을 허용 합니다. 토끼는 훨씬 가까이 phylogenetically 영장류 보다 설치류¹⁷, 그리고 outbred 토끼의 큰 유전적 다양성 더 나은 인간의 유전 가변성의 근사치를 구합니다. 유전적 다양성은 전 임상 연구에 대 한 특히 중요 하다는-그들의 자연 목표 유전자 다양 한 인간의 인구에 적용할 수 있는 치료법을 개발 하 여. 많은 경우 모든 다른 모델 종족과 토끼 유전자는 쉽게 복제 또는 토끼 게놈 높은 범위와 시퀀싱 되어 있기 때문에 합성 (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. 다른 큰 동물 모델 (개, 돼지, 양 등)에 비해, 토끼는 상대적으로 저렴 하 게 구입할 고 집 그리고 그들은 쉽게 번 식 하 고 처리할 수 있습니다. 토끼 각 특정 혈관 질환 모델이 원고^8,,1218의 범위는 인간 질병의 모델로 자신의 장점과 단점을가지고 있습니다. 이러한 장점과 단점 토끼 특정 실험적인 질문에 응답 하기 위한 최고의 모델 인지 확인 하는 조사 검토 해야 합니다.

소개 deoxyribonucleic 산 (DNA) 규제 시퀀스 vivo에서 내 피 세포의 복잡 한 생리 환경에서 이러한 시퀀스의 활동의 조사 수 있습니다. 생체 외에서 연구 transfected 내 피 세포에서 DNA 규제 시퀀스;의 초기 평가 대 한 유용할 수 있습니다. 그러나, 연구는^5,,1920반복 vivo에서때 조직 문화 모델에서 식 수준 하지 재현 가끔은. 생체 외에서 시스템 교양된 혈관 세포; 사이 단백질 신호 및 내 피 생리학 뿐 아니라 통신의 기본 경로 탐색 하는 데 유용 수도 있습니다. 그러나, 더 복잡 한 경로 또는 인접 혈관 세포 또는 면역 체계의 복잡 한 인구에 의해 영향을 규제 네트워크는 최고의 공부 했다 vivo에서 시스템^6,20에서. 여기 설명 하는 방법을 그대로 선박, 또는 질병 없이 컨텍스트 내에서 endothelium에 transgene 식의 규정을 탐험을 위한 플랫폼을 제공 합니다. Vivo에서 시스템은 또한 생리 및 병 적인 세포 누화의 조사 및 면역계 유전자 식⁶의 규정에의 기여의 식별을 허용합니다.

(마우스)에 특히 세균 선 transgenesis 감독 transgene 식 내 피 세포에 대 한 대체입니다. 이 이렇게 평생 transgene 식 내 피 특정 발기인 또는 규제 지역^21,22에 의해 중재 대상으로 제공할 수 있습니다. 그러나, 유전자 변형 마우스의 세대는 어렵고 비싼, 여러 유전자 변형 라인 원하는 세포 유형과 성과의 적절 한 transgene 식 수준, 그리고 실험을 transgene의 되도록 자주 테스트 해야 합니다. murine 시스템에서 결과 스트레인-종속 될 수 있습니다. 내 피-타겟 transgenes murine 유전자 변형 모델에는 많은 이점이 있다: 필요가 없습니다 모든 실험 동물에 transgenesis를 달성 하기 위해 수술을 수행 하는, 실험 쥐에서 수많은 다른 사용 가능한 유전자 변형 마우스 사육 될 수 있다 유전 그리고 phenotypic 상호 작용을 테스트 하 고 고기의 특성화 촉진 murine 단백질으로 반작용 하는 항 체의 다양 한 선택이 있다. 그러나, 일반적으로 세균 선 endothelium에 transgenes의 대상으로 맥 관 구조,²² 는 transgene 제품 역할을 하는 사이트를 확인 하 고 어려운 걸쳐 transgene 식에서 발생 합니다. 이것은 특히 사실 때 transgene 제품 분 비 transgene 제품은 맥 관 구조에 걸쳐 내 피 세포에 의해 분 비 동물 내에서 사이트의 모든 번호에 생물 학적 활동을 할 수 있기 때문에. 이 원고에서 설명 하는 방법이 필요한 전문 기술 및 특수 시설, 비록 적은 시간이 소요 하 고 내 피 관련 유전자 변형 마우스 선 개발 보다 저렴 수 있습니다. 그것은 큰 동맥의 세그먼트의 내 피 세포에 선택적으로 단백질의 기능 평가 대 한 허용 하 고 (제거 실험 사이에서 다를 수 있는 체계 요소 쌍 컨트롤로 contralateral 일반적인 경 동맥의 사용 허가 동물-예를 들어 혈압 이나 콜레스테롤 수치-통제 변수로).

유전자 치료는 혈관 질환의 치료를 위한 유망한 접근 특히 만성 질환, 하나의 응용 프로그램 치료 유전자²³의 지속적인 또는 아마도 평생 식을 제공할 수 있기 때문에. 유전자 치료의 치료 약속 체세포 유전자 이동, 종종 간^24,25, 많은 혈액을 매개로 바이러스 성 벡터는 hepatotropic 때문에 상대적으로 쉬운 목표는 대상의 동물 모델에서 탐험 되었습니다. 그러나, 혈관 질환에 효과를, 유전자 치료 대상으로 하는 간 단백질의 조직 overexpression를 달성 해야 한다. 이 일반적으로 독성 또는 심지어 치명적인²⁶수 있는 벡터의 큰 복용량을 요구 한다. 또한, 조직 수준의 단백질 인상 복잡 하 게 되거나 심지어 모호한 실험 결과의 해석 수 있는 대상에서 부작용의 위험을 증가. 이 원고에 설명 된 대로 혈관 피를 대상으로 지역 유전자 치료 생긴된 벡터 transduced 동맥 세그먼트를 넘어 널리 전파 하지 및 로컬 혈관 효과 없이 달성 될 수 있다 때문에 전신 부작용을 피할 수 있는 조직의 플라즈마 수준의 단백질의 변화입니다. ²⁷ 또한, 벡터의 훨씬 낮은 금액은 강력한 간 변환을 달성 하는 데 필요한 보다는 동맥 세그먼트 transduce 데 필요 하다. 간에서 Transgene 식 세포 회전율, 높은 수준의 transgene 식 유지 되어야 하는 경우 반복 주입 요구 때문에 아마 시간이 지남에 감소 보고 되었습니다. ²⁸ 반대로, endothelium의 낮은 이직 률 안정적인 식을 차 우 먹인 토끼에서 적어도 48 주 동안 고 콜레스테롤 먹인 토끼의 동맥 경 화성 병 변에서 24 주 이상에 대 한 제공합니다. ^{1 , 27}

토끼 일반적인 경 동맥 내 피에 유전자 이동 방법은 적절 한 경우 확인 하려면 장단점 (표 1) 구체적인 연구 목표의 맥락에서 고려 되어야 한다. 이 방법의 이점은 포함 한다: outbred 토끼는 타고 난된 쥐 (전 임상 작업에 대 한 중요 한); 보다 인간의 유전적 다양성의 더 나은 대표 쉽게 조작에 대 한 더 큰 배와 분석; 대 한 더 많은 조직을 제공 하는 토끼 메서드는 endothelium 타겟 transgene 식 세균 선 유전자 변형 쥐; 대상으로 내 피는 것 보다 훨씬 더 신속 하 게 얻을 수 있습니다. 벡터 복용량 transgene 식;의 모델 변수 수준으로 쉽게 조정 될 수 있다 큰 동맥 내 피에 특정 프로세스를 조사 수 있다; 고 현지 혈관 transgenesis 제어, 통제 변수로 체계적 요인 제거로 사용 될 동일한 동물에 반대 경 있습니다. 단점: 특별 한 시설 전문 됩니다; 실험 하는 몇몇 유전자 변형된 배경 쥐; 보다 토끼에서 사용할 수 있습니다. 그리고 토끼 마우스 단백질 (transgene 단백질 및 실험 결과 해석에 중요 한 될 수 있는 다른 항 원 immunodetection)에 대 한 대에 항 체의 덜 광범위 한 선택이 있다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 방법을 워싱턴 사무실의 동물 복지 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인 했다 그리고 모든 준수에 따라 완료 했다 관련 규정 및 제도 지침입니다. 참고: 유전자 이동 토끼 일반적인 경 동맥을 토끼에는 마 취 또는 도우미의 도움으로 외과 의사에 의해 수행 됩니다. 1. 유전자 이동 토끼 일반적인 경 동맥에: 사전 작업 토끼 anesthetize 토…

Representative Results

자신감으로이 메서드를 구현 하려면 예비 실험 연산자 luminal 내 피 세포에서 주로 transgene 식으로 효율적이 고 재현 가능한 유전자 이동 달성을 설정 하는 데 필요한 있습니다. 우리의 경험에서는, 이것은 가장 쉽게 β-galactosidase 표현 하는 벡터를 사용 하 여 평가. 양이 많은 반전 녹음 방송 중 합 효소 사슬과 β-galactosidase mRNA (메신저 RNA)의 측정으로 벡터 주입 후 3 일을 제?…

Discussion

수술 방법의 장점을 특히 주의. 전체 노출 및 유전자 arteriotomy 및 수리를 용이 하 게 주의 해 부 지를 통해 일반적인 경 동맥의 동원. 그러나, 해 부, 중 경 동맥의 직접 조작은 vasospasm을 방지 하기 위해 최소화 한다. 또한 출혈이 동맥에 인접 한 거 즈와 가벼운 압력을 적용 하 여 중지 해야 하 고 extravasated 혈액 정리 해야 즉시 일반적인 염 분으로 영역을 rinsing 하 여. 그것은 또한 일반적인 경 동맥에…

Materials

Disposables
3mL syringe with 24G needle	Becton Dickinson	309571	2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle	Becton Dickinson	309623	6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock	Nipro Medical Corp	JD+20L
Catheters, 24G x 3/4"	Terumo Medical Products	SROX2419V
19G needle	Becton Dickinson	305187	Gene transfer surgery only
21G needle	Becton Dickinson	305165	For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4"	Dynarex	3242	~10-15 per surgery
3-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-244
5-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-182	Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture	CP Medical	8648P	Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	421A	Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	398A	Gene transfer surgery only
Alcohol swabs	Covidien Ltd.	6818	For placement of I.V. line
Catheter plug	Vetoquinol	411498	Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL	Vedco Inc.	05098916106
Xylazine, 100 mg/mL	Akorn Inc.	4821
Lidocaine HCl, 2%	Pfizer	00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5%	Pfizer	00409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL	Patterson Veterinary	12496075705	Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride	Baxter	2B1309	2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL)	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr	Apotex Corp.	NDC 60505-7006-2	Gene transfer surgery only
Isoflurane	Multiple vendors	Catalog number not available
Gene transfer vector			Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight	Roboz	RS-7900	Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt	Roboz	RS-6828
Needle holder /w suture scissors	Miltex	8-14-IMC	Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors	Roboz	RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock	Roboz	RS-6412	Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt	Roboz	RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs	Roboz	RS-6514	2x
Backhaus towel clamp 3.5"	Roboz		4x
Micro clip setting forceps 4.75"	Roboz	RS-6496	Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm	Roboz		2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width	Roboz	RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm	Roboz	RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip	Roboz	RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips	Roboz	RS-7110	2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips	Roboz	RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips	Roboz	RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips	Roboz	RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width	Roboz	RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width	Fine Science Tools	11092-12	2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight	Fine Science Tools	11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode	MACAN Manufacturing	HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump	Multiple vendors	Catalog number not available
Forced air warming unit	3M	Bair Hugger Model 505	Gene transfer surgery only
IV infusion pump	Heska	Vet IV 2.2	Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger	Multiple vendors	Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor	Surgivet	Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit	MACAN Manufacturing	MV-9
Surgical microscope	D.F. Vasconcellos	M900	Needs ~16x magnification