Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen
Summary
Mäuse sind ein unschätzbares in Vivo -Modell, Infektionen und Krankheiten, die durch Magen-Darm-Mikroorganismen zu studieren. Hier beschreiben wir die Methoden zur Untersuchung der bakteriellen Besiedelung und histopathologische Veränderungen in Mausmodellen von Helicobacter Pylori-Krankheiten.
Abstract
Helicobacter Pylori ist ein Magen-Erreger, die in der Hälfte der Weltbevölkerung vorhanden ist und ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität beim Menschen. Mehrere Maus-Modellen der Magen Helicobacter -Infektion wurden entwickelt, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, wobei die H. Pylori -Bakterien besiedeln den Magen des menschlichen Wirte und Krankheiten verursachen. Hier beschreiben wir Protokolle: 1) bereiten Sie bakterielle Aufhängungen für die in-Vivo -Infektion von Mäusen über eines-Magensonde; (2) bestimmen Sie bakterienbesiedlung in Maus Magen Gewebe, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und tragfähige zählen; und 3) krankhafte Veränderungen durch Histologie zu beurteilen. Um Helicobactäh Infektion bei Mäusen zu etablieren, bestimmten Pathogen-freies (SPF) Tiere sind zunächst mit Suspensionen (mit ≥105 koloniebildenden Einheiten KBE) der Maus besiedeln entweder Helicobacter Pylori -Stämme beimpft oder andere Magen Helicobacter spp. von Tieren, wie z. B. Helicobacter Felis. Zu den entsprechenden Zeitpunkten nach der Infektion sind Mägen ausgeschnitten und seziert sagittal in zwei gleich gewebefragmente, jeweils bestehend aus den Regionen Antrum und Körper. Eines dieser Fragmente wird verwendet für tragfähige zählen oder DNA-Extraktion, während die anderen histologischen Verarbeitung unterliegt. Bakterielle Besiedlung und histopathologische Veränderungen im Magen können routinemäßig im Magen Gewebeschnitte gebeizt mit Warthin-Starry, Giemsa oder Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken, entsprechend bewertet werden. Zusätzliche immunologische Analysen darf auch von Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz auf Maus Magen Gewebeschnitte vorgenommen werden. Die nachfolgend beschriebenen Protokolle sind speziell für die Beurteilung bei Mäusen der gastrischen Krankheiten ähnlich denen in Mensch-im Zusammenhang mit H. Pylori ermöglichen Krankheiten, einschließlich Entzündung, Atrophie der Drüse und lymphoide Follikel Bildung. Das Inokulum Vorbereitung und eines-Magensonde Protokolle können auch an die Pathogenese der anderen magensaftresistenten humanpathogene Erreger zu studieren, die Mäuse, wie Salmonella Typhimurium oder Citrobacter Rodentiumbesiedeln angepasst werden.
Introduction
Helicobacter Pylori ist eine spiralförmige, Gramnegative, menschlichen Magen Erreger vorhanden in allen Bevölkerungsgruppen auf der ganzen Welt, mit Infektionsraten in den Entwicklungsländern, die voraussichtlich in der Größenordnung von 80 %1. Obwohl die meisten H. Pylori-infizierte Personen asymptomatisch sind, einige schwere Krankheiten, Magenkrebs2von Verdauungs-Geschwüre bis zu entwickeln. H. Pylori-assoziierten Krebsarten im großen und ganzen zeichnen sich durch bösartige Veränderungen in Epithelzellen (GECs) oder durch die Bildung von extra nodal lymphatischen Gewebe im Magen, wodurch Magen Adenokarzinom oder Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom, beziehungsweise. H. Pylori ist sehr angepasst, um zu überleben in der rauen ökologische Nische des Magens durch die Anwesenheit von verschiedenen Virulenzfaktoren und Mechanismen, die Erleichterung der Einhaltung, Wachstum und Stoffwechsel in dieser Nische. Insbesondere besitzen virulente Stämme von H. Pylori 40 kb Cag Pathogenität Insel (CagPAI), die ungefähr 30 Gene für die Produktion einer Typ 4-Sekretion System (T4SS)3,4 erforderlichen kodiert . CAG PAI-positiven H. Pylori -Stämme sind verbunden mit der Induktion von höheren Ebenen der chronischen Entzündung in der Hostie, die als ein wesentlicher Vorläufer der Magen Adenokarzinom5verwickelt hat.
In Vivo Tiermodellen, insbesondere Mäuse wurden dadurch, dass Forscher untersuchen die relativen Beiträge der Host, bakterielle und umweltbedingten Faktoren auf H. Pylori -Infektion und Krankheit Ergebnis6sehr informativ. Studien haben bisher gezeigt, die verlängerte H. Pylori Infektion der Mäuse C57BL/6 genetischen Hintergrund Ergebnisse bei der Entwicklung von chronischer Gastritis und Drüse verkümmert, beide Kennzeichen von H. Pylori -Infektion-7. Infektion mit den verwandten Bakterienarten Katze/Hund, H. Felis, ist darüber hinaus nachweislich induzieren Malz Bildung bei Mäusen mit ähnlichen Pathologie und Fortschreiten der Krankheit wie im menschlichen MALT-Lymphom8,9zu sehen. Die am häufigsten verwendeten H. Pylori Isolat in Studien an Mäusen Kolonisation ist die “Sydney Sorte 1” (SS1) Belastung10, die CagPAI+ , sondern hat ein nicht-funktionale T4SS (T4SS−)11. Andere weit verbreiteten Sorten sind H. Pylori B128 7.13 (CagPAI+/T4SS+)12 und X47-2AL (CagPAI–/T4SS−)13. Für H. Felis Infektionen, die Belastung CS1 (“Cat Spirale 1”, CagPAI–/T4SS−) ist in der Regel verwendete14.
Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Helicobacter Impfkulturen für in-Vivo -Infektion, das Verfahren für die eines-Magensonde von Mäusen, sowie Methoden für die Verarbeitung von Gewebe für die Untersuchung von histopathologischen Veränderungen in den Magen. Insbesondere konzentriert sich dieser Artikel auf die histologischen Methoden zur bakteriellen Besiedelung zu visualisieren und histopathologische Veränderungen, einschließlich der Malz-Bildung in der Magenschleimhaut von infizierten Mäusen zu beurteilen. Einige der hier beschriebenen Methoden kann das Studium der andere Darm-Erreger wie S. angepasst werden. Typhimurium oder C. Rodentium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von einem in-Vivo -Mausmodell für Helicobacter -Infektion. Die entscheidenden Schritte des Verfahrens sind die: 1) Vorbereitung der Helicobacter Inokula, lebensfähige und bewegliche Bakterien; (2) Lieferung der entsprechenden Zahl von Bakterien an die Maus über eines-Magensonde; (3) Nachweis von bakteriellen Infektionen durch koloniezahlbestimmung und/oder PCR; und 4) Verarbeitung von Magen Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Histopathologie in …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Frau A. De Paoli und Frau Georgie Wray-McCann für technische Unterstützung danken. Die Autoren erkennen Nutzung der Einrichtungen und technische Unterstützung von Monash Histologie Plattform, Institut für Anatomie und Entwicklungsbiologie, Monash University. Das Labor wird unterstützt durch Mittel aus der National Health and Medical Research Council (NHMRC) für RLF (APP1079930, APP1107930). RLF wird von einem Senior Research Fellowship von NHMRC (APP1079904) unterstützt. KD und MC sind beide von Monash Graduate Stipendien unterstützt. KD wird unterstützt vom Zentrum für angeborene Immunität und infektiöse Erkrankungen, Hudson Institute der medizinischen Forschung, während MC ein International Postgraduate Stipendium von der Fakultät für Medizin, Pflege und Gesundheitswissenschaften, Monash University hat. Forschung am Hudson Institute of Medical Research wird von der Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support-Programm unterstützt.
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Referências
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