Os ratos representam um modelo inestimável na vivo para estudar a infecção e doenças causadas por microorganismos gastrointestinais. Aqui, descrevemos os métodos utilizados para estudar a colonização bacteriana e alterações histopatológicas em modelos do rato do Helicobacter pylori-doenças relacionadas.
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Artigo de método
Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico que está presente em metade da população mundial e é uma importante causa de morbidade e mortalidade em seres humanos. Vários modelos de rato da infecção gástrica por Helicobacter foram desenvolvidos para estudar os mecanismos moleculares e celulares, segundo o qual a bactéria H. pylori coloniza o estômago de hospedeiros humanos e causar doença. Aqui, descrevemos os protocolos: 1) preparar suspensões bacterianas para a infecção na vivo de ratos através de gavagem intragástrico; 2) determinar os níveis de colonização bacteriana nos tecidos gástricos de rato, por reação em cadeia da polimerase (PCR) e a contagem viável; e 3) avaliar as alterações patológicas, pela histologia. Para estabelecer Helicobacter infecção em ratos, os animais (SPF) isentos de agentes patogénicos específicos primeiro são inoculados com suspensões (contendo ≥ 105 unidades formadoras de colônia, CFUs) de cepas de rato-colonização de qualquer Helicobacter pylori ou outros gástrica spp. Helicobacter de animais, tais como felis Helicobacter. A pós-infecção pontos de tempo apropriado, estômagos são extirpados e dissecados essas em dois fragmentos de tecido igual, cada um compreendendo as regiões de antro e corpo. Dentre estes fragmentos é usado para contagem viável ou extração de DNA, enquanto o outro é submetido a processamento histológico. Colonização bacteriana e alterações histopatológicas no estômago poderão ser avaliadas rotineiramente em seções do tecido gástrico manchadas de Warthin-Starry, Giemsa ou hematoxilina e eosina (H & E) manchas, conforme apropriado. Análises imunológicas adicionais também podem ser efectuadas por imuno-histoquímica ou imunofluorescência em secções de tecido gástrico de rato. Os protocolos descritos abaixo são projetados especificamente para permitir a avaliação em ratos de patologias gástricas, parecidos com os de humanos relacionados com H. pylori doenças, incluindo inflamação, atrofia da glândula e formação de folículos linfoides. A preparação do inóculo e protocolos de gavage intragástrico também podem ser adaptados para estudar a patogênese de outros patógenos humanos entéricos que colonizam a ratos, tais como Salmonella Typhimurium ou Citrobacter rodentium.
Introdução
Helicobacter pylori é um patógeno gástrico em forma de espiral, Gram-negativo, humano presente em todas as populações em todo o mundo, com taxas de infecção nos países em desenvolvimento, estima-se que na ordem de 80%1. Embora a maioria dos H. pylori-indivíduos infectados são assintomáticos, alguns desenvolvem doenças mais graves, variando de ulceração péptica a câncer gástrico2. H. pylori-cancros associados amplamente são caracterizadas por alterações malignas nas células epiteliais (GECs) ou pela formação de tecidos linfoides extra nodais no estômago, resultando em adenocarcinoma gástrico ou ....
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Protocolo
1. crescimento e preparação de inóculos bacterianos
- Descongelar a existências de glicerol de H. pylori ou H. felis15 de-80 ° C e a subcultura em placas de ágar sangue (HBA) cavalo compreendendo: Agar sangue Base n º 2 (ver Tabela de materiais); uma modificada "Suplemento de Skirrow seletivo antibióticos" (consistindo de vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL trimetoprim, 5 µ g/mL; anfotericina B, 2,5 μg/mL); e 5 – 10% (v/v) cavalo sangue15,16. As bactérias crescem bem em condições de microaerobic em 2.5 ou 3.5 L anaeróbicos frascos con....
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Resultados
Este protocolo descreve uma técnica de gavagem oral para alcançar intragástrico infecção com H. pylori ou H. felis em modelos do rato murino (Figura 1). Após eutanásia, estômagos são removidos, pesados e divididos em 2 metades iguais, compreendendo os antro, corpo e regiões não-glandular dos tecidos gástricos (Figura 2). A região não-glandular é removida antes de realizar qualquer análise.
Colonização bem sucedida do.......
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Discussão
Este protocolo descreve a utilização de um modelo de rato in vivo de Helicobacter infecção. Os passos críticos do processo são a: 1) preparação de inóculos de Helicobacter contendo bactérias motile e viáveis; 2) a entrega dos números adequados de bactérias para o mouse através de gavagem intragástrico; 3) a detecção da infecção bacteriana por contagem de colônia e/ou PCR; e 4) processamento de tecidos gástricos para permitir a avaliação da histopatologia em infectados estômagos. Mais sugestões .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer a Sra. r. De Paoli e MS. Georgie Wray-McCann para assistência técnica. Os autores reconhecem a utilização das instalações e assistência técnica da plataforma de histologia de Monash, departamento de anatomia e biologia do desenvolvimento, Universidade de Monash. O laboratório é suportado pelo financiamento da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) para RLF (APP1079930, APP1107930). RLF é apoiado por uma bolsa de pesquisa sênior do NHMRC (APP1079904). KD e MC são suportados por bolsas de pós-graduação de Monash. KD também é apoiado pelo centro de imunidade inata e infecciosa doenças, Hudson Instituto de pesquisa médica, en....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes bacteriológicos | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolver em água deinonizada antes da esterilização |
| Sangue de cavalo desfibrinado premium | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolva em água desinonizada antes da esterilização |
| Pacotes de gás CampyGen | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Reagentes histológicos | |||
| Formalina, tamponado neutro, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Álcool absoluto, 100% desnaturado | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xileno (sem enxofre) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filtro antes do uso |
| Eosina, Coloração Aquosa | Amber Scientific | EOCA-1L | Filtro antes do uso |
| Coloração Wright-Giemsa, modificado | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Diluir antes de usar (20% Giemsa, 80% água deionizada) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX meio de montagem | VWR | 1.00579.0500 | |
| Reagentes de biologia molecular | |||
| Qubit dsDNA BR Kit de ensaio | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotídeos | Sigma Aldrich | A temperatura de recozimento dos primers ureB usados neste estudo é de 61 &graus; C | |
| GoTaq Flexi DNA Polimerase | Promega | M8291 | O kit inclui 10x tampão PCR e dNTPs de cloreto de magnésio |
| Bioline | BIO-39028 | Diluir a 10 mM em água livre de nuclease estéril antes de usar | |
| Grau molecular | Agarose Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnésio Sulfato Heptahidratado | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibióticos | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolver em água deionizada |
| Polimixina B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolver em água deionizada |
| Trimetoprim (≥ 98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolver em 100% (absoluto) Etanol |
| Anfotericina | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolver em água deionizada |
| Bacitracina de Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolver em água deionizada |
| Ácido naladícico | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolver em água deionizada |
| Outros reagentes | |||
| Metoxiflurano (Pentrhox) | Medical Developments International | Não aplicável | |
| Cera | parafina Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipamento e material plástico | |||
| Frascos anaeróbicos de oxóide | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipetas | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrífuga | Colete pellets bacterianos por centrifugação a 2.200 rpm por 10 minutos a 4 &graus; | ||
| Agulha de deslizamento de precisão C 23 g | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Tubo de polietileno de furo fino Portex | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Cateteres de alimentação de plástico | Instech Laboratórios | FTP20-30 | |
| Seringas descartáveis de 1 mL tuberculina luer slip | BD Bioscience | 302100 | |
| Micropilão Eppendorf para tubos de 1,2 - 2 mL | Pilões de polipropileno autoclaváveis Sigma Aldrich Z317314 usados para homogeneização do estômago | ||
| Dissociador GentleMACs | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use um gentleMACS predefinido Programas para tecido estomacal de camundongo |
| Tubos M (tampa laranja) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Fluorômetro Qubit | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Loop de plástico estéril | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Sistema de Incorporação | Leica Biosystems | Não aplicável | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Sistema Uni- | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus lâminas de vidro | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
Referências
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori su....
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Reimpressões e permissões
