التصور للوحدات القشرية في الأرض كورتيسيس الثدييات
Summary
توضح هذه المقالة منهجية مفصلة الحصول على مقاطع عرضية مسطح من الثدييات كورتيسيس ووضع تصور للوحدات القشرية باستخدام histochemical وأساليب المناعي.
Abstract
قشرة أدمغة الثدييات بارسيلاتيد في هياكل فرعية منفصلة أو الوحدات النمطية. الوحدات القشرية عادة ما تقع موازية للورقة القشرية، ويمكن أن تحدد ببعض الأساليب histochemical والمناعي. في هذه الدراسة، نسلط الضوء على أسلوب لعزل القشرة من الثدييات العقول وتسطيح لهم الحصول على التوازي المقاطع إلى ورقة القشرية. ونحن كذلك تسليط الضوء على تحديد histochemical وأساليب المناعي تجهيز هذه الأرض مقاطع عرضية لتصور الوحدات القشرية. في قشرة somatosensory الثدييات المختلفة، نقوم هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز للكشف عن خرائط الجسم أو الوحدات القشرية التي تمثل أجزاء مختلفة من جسم الحيوان. في قشرة entorhinal الآنسي، منطقة حيث يتم إنشاء خلايا الشبكة، فنحن نستخدم أساليب المناعي لتسليط الضوء على نماذج من الخلايا العصبية مصممة وراثيا التي يتم ترتيبها في نمط شبكة في ورقة القشرية عبر العديد من الأنواع. وعموما، نحن نقدم إطارا لعزل وإعداد لاييرويسي دكت أبواب القشرية، ووضع تصور للوحدات القشرية باستخدام histochemical وأساليب المناعي في مجموعة متنوعة واسعة من أدمغة الثدييات.
Introduction
ويمكن ملاحظة بعض أهم التغييرات في بنية الدماغ عبر نسأله في قشرة الدماغ. وعلى الرغم من الاختلافات الكبيرة، قشرة الحيوانات يتبع نمط شائع ويمكن تقسيم بطريقتين متميزة، ب الطبقات والمجالات1. الطبقات القشرية تقع موازية لسطح الدماغ وتختلف في عدد من الطبقات 3 في كورتيسيس الزواحف2 إلى 6 طبقات في الثدييات كورتيسيس1. المناطق القشرية من ناحية أخرى مناطق متميزة من القشرة التي تتوافق إلى حد كبير مع وظائف متميزة، مثل، قشرة somatosensory تشارك في الإحساس باللمس أو القشرة البصرية في تجهيز مرئي المدخلات. هذه المناطق القشرية يمكن غالباً تقسيمها إلى بقع أو الوحدات النمطية3، الذي يتم بانتظام تكرار الهياكل التشريحية، وجدت أساسا موازيا للسطح بيل في الدماغ. الوحدات القشرية قد تقتصر على طبقة معينة4، أو تمتد عبر عدة طبقات5.
أساليب تقطيع القياسية للدماغ إشراك الأقسام العادية إلى السطح في الدماغ، مثل الاكليلية أو السهمي. وفي حين يمكن استخدام هذه الأساليب لتصور الوحدات القشرية، يمكن كشف العديد من الميزات للاهتمام عندما يتم تصور الوحدات القشرية عرضية، في طائرة موازية لسطح الدماغ. على سبيل المثال، وحدات سوماتوسينسوري في الدماغ القوارض تمثل شعيرات، تظهر كبرميل عند تصور العادي على سطح الدماغ، وهكذا تستمد المناطق القشرة البرميل اسم. ومع ذلك، في تصور برميل في اتجاه عرضية، أنها تكشف خارطة الخط الطولي، مع برميل يجري المنصوص عليها في اتجاه طبوغرافية النسخ المتطابق على التخطيط الدقيق لشعرات على سطح الجسم الخارجي. وفي بعض الحالات، حتى هرب ترتيب وحدات الكشف لفترات طويلة، عندما تصور بطريقة غير عرضية. قشرة انتورهينال الآنسي، المعروف لوجود خلايا الشبكة، الخلايا العصبية التي تطلق في نمط سداسية منتظمة عند حيوان هي تعبر بيئة. على الرغم من أنها منطقة يتم التحقيق بشكل كبير، حتى الآونة الأخيرة، وجود بقع أو وحدات من الخلايا الموجودة في قشرة entorhinal الآنسي، الذي ترد جسديا في نمط سداسية6، هرب الكشف. الوجود وترتيب هذه الوحدات، في الدماغ الفئران، تيسرت بصنع مقاطع عرضية من قشرة انتورهينال الآنسي والتحقيق في سيتوارتشيتيكتوري بطريقة لاييرويسي.
بعد تمزيقها، يمكن أيضا تحقيق جانب معين من التصور للوحدات القشرية بطرق متعددة. تقليديا، قد حددت الدراسات الوحدات النمطية استناداً إلى الخلية الكثافة أو الألياف تخطيط1. نهج شعبية آخر هو استخدام هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز، الذي يكشف عن مجالات النشاط العالي8. وتشمل النهج الجديدة تبحث في أنواع الخلايا المحددة وراثيا، تميز على أساس هم البروتين التعبير ملامح6،8.
في هذه الدراسة، نسلط الضوء على الأساليب عزل القشرة من أدمغة الثدييات والحصول على مقاطع عرضية مسطح، وتصور الوحدات القشرية على أساس هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز وإيمونوهيستوتشيميستري من البروتينات نوع من الخلايا المحددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم التعرف على نمطية في قشرة الدماغ باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. خلية الدراسات المحددة عادة أقرب الوحدات القشرية التي تصور أما المناطق كثيفة، أو عدم وجود ألياف1. وقد استخدمت أساليب اللاحقة وجود حزم الجذعية24، أفيرينتس من منطقة معينة25، أو إثراء …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها “جامعة هومبولت” زو برلين، مركز “برلين علم الأعصاب الحسابية” بيرنشتاين، المركز الألماني لأمراض الأعصاب (دزني) والوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الألمانية، Förderkennzeichen 01GQ1001A)، نيوروكوري، وغوتفريد فيلهلم لايبنتز جائزة DFG. ونحن نشكر شيمبي ايشياما لتصميم الرسوم البيانية ممتازة وديديريتشس جولين للمساعدة التقنية الممتازة.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Referências
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
