Görselleştirme düzleştirilmiş memeli Cortices'deki kortikal modülleri
Summary
Bu makalede, düzleştirilmiş teğet bölümleri memeli cortices elde etmek ve histochemical kullanarak kortikal modülleri ve immunohistokimyasal yöntemleri görselleştirmek için detaylı bir metodoloji.
Abstract
Memeli beyin korteksi farklı ayarlamış veya modüller içine parcellated olduğunu. Kortikal Modüller genellikle kortikal sayfasına paralel yalan ve bazı histochemical ve immunohistokimyasal yöntemlerle belirlendi. Bu çalışmada, bir yöntem üzerinden memeli beyin korteksi yalıtmak ve onları bölümleri paralel kortikal sayfasına almak için Düzleştir’i vurgulayın. Daha ayrıntılı vurgulamak seçilen histochemical ve bunlar işlemeye immunohistokimyasal yöntemleri basık kortikal modülleri görselleştirmek için teğet bölümleri. Çeşitli memeliler somatosensor korteks vücut haritalar veya hayvan vücudun farklı parçaları temsil eden kortikal modülleri ortaya çıkarmak için sitokrom oksidaz histochemistry gerçekleştiriyoruz. Medial entorhinal korteks, ızgara hücreleri burada üretilen, bir alanı modülleri bir düzende kılavuz-kortikal sayfasında çeşitli türler arasında düzenlenmiş olan genetik olarak belirlenen nöronların vurgulamak için immunohistokimyasal yöntemleri kullanmak. Genel olarak, biz yalıtmak ve layer-wise hazırlamak için bir çerçeve kortikal bölümleri basık ve histochemical kullanarak kortikal modülleri ve immunohistokimyasal yöntemleri çok çeşitli memeli beyni görselleştirmek sağlar.
Introduction
Phylogeny genelinde beyin yapısındaki en büyük değişikliklerden bazıları serebral korteks görülebilmektedir. Önemli farklılıklara rağmen korteks hayvanların ortak bir desen takip ediyor ve genel olarak iki farklı şekilde, Katmanlar ve alanları1tarafından ayrılabilir. Kortikal katmanları beyin yüzeyine paralel yalan ve memeli cortices16 kat arası sürüngen cortices2 3 kat sayı değişir. Kortikal alanlarda diğer yandan büyük ölçüde farklı işlevleri için örneğinkarşılık gelen farklı korteks bölgelerinde, somatosensor korteks touch veya görsel girdi işleme görsel korteksin hissi ilgilenmektedir. Bu kortikal alanlarda genellikle yamalar veya modülleri3, hangi temelde beyin pial yüzeyine paralel bulunan anatomik yapılar, düzenli tekrarlanan bölünmüştür. Kortikal modülleri çeşitli katmanları5arasında genişletebilir veya belirli katman4sınırlı.
Standart parça yöntemleri beyin koronal veya sagittal gibi beyin yüzeye normal bölümler içerir. Bu yöntemler kortikal modülleri görselleştirmek için kullanılan iken, kortikal modülleri yüzeysel, beyin yüzeyine paralel düzlemdeki görüntülenir zaman ilginç özellikleri çok sayıda açığa çıkarılabilir. Örneğin, bıyık, temsil eden kemirgen beyin somatosensor modüllerde beyin yüzeye normal görüntülenir zaman varil olarak görünür ve böylece bölgeleri isim varil korteks türetmek. Ancak, varil teğet yönde görüntülenmesi, aynı bir bıyık harita Topografik bir yönde bıyık dış vücut yüzeyi tam düzenini yansıtması laid dışarı varil ile ortaya koyuyor. Belirli durumlarda, modüler düzenleme bile önemli dönemlerini için algılama kaçtı ne zaman teğet olmayan bir şekilde görüntülenir. Medial entorhinal korteks ızgara hücreleri, bir hayvan bir ortamda çaprazlayan bağlandığınızda bir düzenli altıgen şeklinde ateş nöronlar varlığı için bilinir. Son zamanlarda, yamalar varlığı veya medial entorhinal korteks hücrelerinin modülleri kadar ağır incelenen bir alan olmasına rağmen hangi fiziksel olarak bir Altıgen desen6‘ da koyulur kaçtı algılama. Varlığı ve bu modüllerde sıçan beyin düzenlenmesi medial entorhinal korteks teğet bölümlerini yapma ve cytoarchitecture layer-wise bir şekilde araştırıyor tarafından kolaylaştırdı.
Kesit ardından, görselleştirme kortikal modüllerin belirli durumuyla aynı zamanda birden fazla yoldan gerçekleştirilebilir. Klasik, çalışmalar modüller hücre yoğunluğu veya lif düzeni üzerinde1dayalı tarif. Başka bir popüler yaklaşım daha yüksek etkinlik8alanlarında ortaya koymaktadır sitokrom oksidaz histochemistry kullanılır. Genetik olarak belirlenen hücre tipleri, onların protein ifade profilleri6,8temel alınarak ayırt bakarak yeni bir yaklaşım içerir.
Bu çalışmada, biz üzerinden memeli beyin korteksi izole, düzleştirilmiş teğet bölümler almak ve kortikal modülleri sitokrom oksidaz histochemistry ve hücre tipi belirli proteinlerin immünhistokimya göre görselleştirmek için yöntemler vurgulayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Serebral korteks modülerlik çeşitli teknikler kullanarak olduğu belirlendi. Her iki görselleştirme tarafından erken genellikle tespit çalışmaları kortikal modülleri yoğun bölgeler veya lifleri1olmayışı hücre. Sonraki yöntemleri dendritik demetleri24, belirli Bölge25afferents varlığı veya zenginleştirme nörotransmitter26kullanılan. Burada iki teknik, sitokrom oksidaz (i) histochemistry ve (ii) immunohi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Humboldt Universität zu Berlin, hesaplamalı nörolojik Berlin Bernstein Merkezi, Alman Merkezi tarafından nörodejeneratif hastalıklar (DZNE), Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma (BMBF, Förderkennzeichen için desteklenmiştir 01GQ1001A), NeuroCure ve Gottfried Wilhelm Leibniz Ödülü DFG. Shimpei Ishiyama için mükemmel grafik tasarım ve Juliane Diederichs mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps – Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps – Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps – Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears – 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
Referências
- Brodmann, K. . Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- . Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- . Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- . Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of “barrels” in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different?. Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal’schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. . Histologie du Systeme Nerveux de l’Homme et des vertébrés. , (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. . Map projections–A working manual (Vol. 1395). , (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
