इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उच्च व्यवहार्यता और जिगर से हेपैटोसाइट्स और sinusoidal endothelial कोशिकाओं की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए है । इस पोर्टल नस के माध्यम से एक प्रकार चतुर्थ collagenase समाधान के साथ जिगर perfusing द्वारा पूरा किया है, अंतर के बाद हेपैटोसाइट्स और sinusoidal endothelial कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए केंद्रापसारक ।
इस प्रोटोकॉल माउस हेपैटोसाइट्स और sinusoidal endothelial कोशिकाओं (सेकेंड) संवर्धन के लिए उपयुक्त या सेल lysates प्राप्त करने के लिए के लिए उच्च उपज और व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल में, पोर्टल नस कैथीटेराइजेशन के लिए साइट के रूप में प्रयोग किया जाता है, बजाय वेना कावा, यह अंतिम जिगर की तैयारी में अंय संभव कोशिका प्रकार के संदूषण सीमा के रूप में । प्रक्रिया के दौरान कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता है । एक जल स्नान गर्मी के एक स्रोत के रूप में सभी बफ़र्स और समाधान के तापमान को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक मानक सिकुड़नेवाला पंप के लिए तरल पदार्थ ड्राइव किया जाता है, और एक प्रशीतित तालिका टॉप केंद्रापसारक केंद्रापसारक प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है । इस तकनीक की ही सीमा है, जो 18-25 जी आकार रेंज में चूहों में से कुछ पर चुनौती दे रहा है पोर्टल नस के भीतर कैथेटर की नियुक्ति । इस तकनीक का एक लाभ यह है कि केवल एक नस छिड़काव के लिए उपयोग किया जाता है और नस के लिए उपयोग जल्दी है, जो ischemia और जिगर है कि यकृत कोशिका व्यवहार्यता को कम कर देता है की reperfusion को कम करता है । इस प्रोटोकॉल के लिए एक और लाभ यह है कि यह आसान है मृत हेपैटोसाइट्स से रहने के लिए सेलुलर घनत्व में अंतर के कारण दृष्टि से जीना अंतर केंद्रापसारक कदम के दौरान । इस प्रोटोकॉल से कोशिकाओं को किसी भी बहाव आवेदन के लिए सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है और साथ ही किसी भी जैव रासायनिक आकलन के लिए कार्रवाई की ।
जिगर की Collagenase छिड़काव हेपैटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए 1950 के दशक के बाद से किया गया है और लगातार1,2,3,4पर सुधार किया गया है । के तरीकों में से कई की एक बहुत अच्छी समीक्षा, तकनीक, और जिगर सेल शुद्धि में इस्तेमाल किया एजेंट मेयेर एट अल5में संकलित किया गया है । अत्यधिक व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स और सेकेंड की एक संतोषजनक उपज प्राप्त करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है । यांत्रिक बलों है कि collagenase की गुणवत्ता सहित कोशिकाओं को अलग चर कि नियंत्रण मुश्किल कर रहे है में से कुछ हैं । यांत्रिक बलों के लिए संवेदनशीलता hepatocyte के कारण, उनके व्यवहार्यता स्पष्ट रूप से उप इष्टतम स्थितियों में कम है, अलगाव के लिए इष्टतम स्थितियों का वर्णन एक प्रोटोकॉल के लिए की आवश्यकता को उत्साह । सेकेंड यांत्रिक कतरनी के प्रति संवेदनशील होने के लिए नहीं दिखाई देते हैं । collagenase पाचन के साथ सीटू छिड़काव में अब तक का सबसे अच्छा तरीका है कोशिका सेल जंक्शनों जिगर और आंत और तिल्ली6जैसे अन्य अंगों से एकल सेल तैयारियों को प्राप्त करने के लिए बाधित करने के लिए. इस प्रोटोकॉल पोर्टल नस में एक बाधक प्लास्टिक कैथेटर का उपयोग करने के बजाय एक चीरा है कि पोर्टल नस पतन के लिए कारण सकता है, के रूप में Smedsrød एट अल7में वर्णित छिड़काव बफर शुरू करने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करता है ।
इस पांडुलिपि के लक्ष्य के लिए सबसे महत्वपूर्ण जिगर फले प्रक्रिया में सफलता के लिए आवश्यक कदम का प्रदर्शन है । इन चरणों कैथेटर प्लेसमेंट, छिड़काव तरल पदार्थ का प्रवाह, और पाचन के बाद ऊतक की हैंडलिंग शामिल हैं । प्रवाह दर रक्त प्रवाह की प्राकृतिक दर से ऊपर समायोजित कर रहे हैं, लेकिन Glisson के कैप्सूल बरकरार रखने के लिए काफी कम है । एक बार जिगर ठीक से पचता है और कोशिकाओं को समाधान में अलग कर रहे हैं, कोशिका शुद्धि अपेक्षाकृत सरल है कि क्या यह अंतर केंद्रापसारक द्वारा किया जाता है, प्लेट आसंजन, या चुंबकीय मनका शुद्धि द्वारा. लाइव हेपैटोसाइट्स एक उच्च घनत्व है और आसानी से nonparenchymal कोशिकाओं से शुद्ध कर रहे हैं (NPCs) और मृत हेपैटोसाइट्स धीमी गति के साथ केंद्रापसारक. अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, Kupffer कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्लेट आसंजन (केसीएस) और सेकेंड एक आम विधि है8, हालांकि वहां रिपोर्ट है कि यह सेकेंड9का सबसे अच्छा शुद्धता का उत्पादन नहीं करता है । केसीएस के लिए ठोस कठोर सतहों का पालन करने की प्रवृत्ति है जल्दी और पेट्री व्यंजन (मानक polystyrene) इस प्रक्रिया के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सामग्री हैं । एसईसी या एंटीबॉडी के प्रयोग के साथ केसी शुद्धि-संयुग्मित चुंबकीय मोती निस्संदेह इन कोशिकाओं की महत्वपूर्ण शुद्धि के लिए सबसे अच्छा तरीका है, हालांकि इस प्रक्रिया को इस प्रोटोकॉल पर एक और 3-4 एच कहते है और कुल मिलाकरउपज9 कम है । इस रिपोर्ट में विस्तार से एक इष्टतम जिगर छिड़काव कि आम तौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं की एक उच्च संख्या पैदावार के लिए प्रक्रिया को दर्शाता है ।
इस प्रोटोकॉल उपकरण है कि उपलब्ध है और है कि उपयोगकर्ता इस प्रक्रिया में सफलता की एक उच्च दर वहन करेगा पर प्रकाश डाला गया । एक सफल छिड़काव प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करते समय किसी भी बहाव आवेदन के लिए मौलिक है ।
वहां प्रक्रिया के कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि सफलता का निर्धारण कर रहे हैं । पहले, पोर्टल नस के भीतर कैथेटर टिप के स्थान सही होना चाहिए । यदि जिगर के अंदर बहुत दूर रखा है, केवल मामूली पालियों perfused किया जाएगा । टिप बस पोर्टल नस की दाईं और बाईं शाखाओं के नीचे होना चाहिए । एक सुई पर एक बहुलक मिश्रित कैथेटर का उपयोग करने का लाभ यह है कि सुई का कंटिया अधिक एक कैथेटर से छिड़काव के दौरान नस आंसू की संभावना है । दूसरा, collagenase गुणवत्ता और मात्रा जिगर के पाचन क्षमता निर्धारित करते हैं । इस प्रक्रिया में, पूर्व-योग्य collagenase प्रकार 4 का उपयोग किया गया था और यह ०.५ मिलीग्राम/एमएल पर बफ़र 2 में reसस्पैंड है यदि collagenase गतिविधि को परख किया जा करने के लिए ९०० IU से अधिक है ।
collagenase छिड़काव के अंत में, जिगर भूरे रंग के लिए एक कुछ अंधेरे तन को बनाए रखने चाहिए । अगर यह हल् के स् तन का रंग है, तो सबसे ज् यादा हेपैटोसाइट्स हैं । जिगर के अलावा गिरने होना चाहिए जब माउस से काट । सबसे अच्छी स्थिति में, जिगर एक छोटी चंमच के साथ माउस के शरीर गुहा के बाहर स्कूप किया जा सकता है । इस हालत में जिगर हमेशा बहुत उच्च कोशिका व्यवहार्यता दे । यदि यह बहुत प्रयास करने के लिए कोशिकाओं को मिलाने के अलावा, अगर जिगर निष्कर्षण के दौरान अभी भी फर्म है, या अगर वहां बल का एक बहुत फिल्टर के माध्यम से हेपैटोसाइट्स कदम की आवश्यकता है, तो हेपैटोसाइट्स एक कम व्यवहार्यता होगा लेता है । हेपैटोसाइट्स microvilli के साथ कवर कर रहे हैं, जो उंहें एक बहुत ही उच्च सतह क्षेत्र (चित्र 10) के लिए अनुमति देता है । अपूर्ण पाचन हेपैटोसाइट्स के बीच सेल सेल जंक्शनों को बरकरार रखती है, और यांत्रिक बाल काटना प्लाज्मा झिल्ली के अलावा आंसू होगा । collagenase के साथ छिड़काव में सीटू के लिए अलग कोशिकाओं को तोड़ने और उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा तरीका है । चित्रा 11में, दो hepatocyte तैयारी की है जिसमें सेल छर्रों की तुलना में कुछ धुल के बाद किया गया है 1 बफर । बाईं तरफ गोली हल्का है और के बारे में ५०% की एक कोशिका व्यवहार्यता शामिल है । सही पर गोली गहरा है और ९२% की व्यवहार्यता है । इसी तरह, जब तरल ५० मिलीलीटर शंकु से डाला जाता है, गहरा गोली ट्यूब के भीतर स्थिर है, लाइटर गोली है, जो ट्यूब में के रूप में तरल बंद डाला जाता है के लिए होगा के विपरीत । लोअर सेल व्यवहार्यता या अक्षम perfusions हो सकता है जब जिगर स्केलेरोसिस के उच्च स्तर है ।
के बाद से जीना हेपैटोसाइट्स मृत हेपैटोसाइट्स की तुलना में एक उच्च घनत्व है, केंद्रापसारक प्रक्रियाओं एक तैयारी है कि व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स15में अत्यधिक शुद्ध है में परिणाम होगा । यदि मृत हेपैटोसाइट्स की एक महत्वपूर्ण राशि है (जो अक्सर होता है जब स्थितियां इष्टतम हैं), जीवित कोशिकाओं को और समृद्ध और PVP ढाल का उपयोग मृत कोशिकाओं से अलग हो सकता है । इसके अतिरिक्त, के बाद से जीना हेपैटोसाइट्स गोली मरे हेपैटोसाइट्स, गोली के ऊपर 3rd की आकांक्षा से तेजी से भी गोली में मृत कोशिकाओं को जीने के अनुपात में वृद्धि होगी । इन प्रक्रियाओं को त्वरित और आसान तरीके है मृत हेपैटोसाइट्स और सेल मलबे से जीना अलग जब10,16की जरूरत है । यह विशेष रूप से उपयोगी है अगर नमूना कीमती है, और केवल कुछ लाख कोशिकाओं के प्रयोग के लिए आवश्यक हैं ।
अंत में, इस जिगर से कटाई हेपैटोसाइट्स और सेकेंड के लिए एक आसान और कारगर तरीका है । वर्तमान कीमतों पर, सभी रिएजेंट और प्रयोज्यता सहित इस प्रक्रिया के प्रदर्शन की लागत ७५ USD प्रति तैयारी के तहत है । यदि एकाधिक चूहों वांछित हैं, यह सबसे अच्छा है hepatocyte शुद्धि के साथ आगे बढ़ना और बर्फ पर एनपीसी अंश रखने जब तक सभी चूहों को संसाधित किया गया है । NPCs आम तौर पर बर्फ पर स्थिर है कम से 5 घंटे के लिए, लेकिन लंबे समय तक इस प्रयोगशाला में परीक्षण नहीं किया गया है ।
The authors have nothing to disclose.
अनुदान R01HL130864 से NIH द्वारा भाग में अनुदान प्रदान किया जाता है ।
1 L Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
250 mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
silicone tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter. |
Tygon tubing | Fisher Scientific | R3603 | Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector. This may also be used for the oxygen tubing. |
T-connectors | Cole-Parmer | EW-06294-82 | |
Quick dissconnects | Fisher Scientific | 6150-0010 | |
Pinch Clamps | Fisher Scientific | 6165-0002 | |
Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70 | Cole-Parmer | EW-07559-00 | Periplastic pump with variable speed |
Pump head, model 7014-20 | Cole-Parmer | EW-07014-20 | |
glass graduated 1.0 mL pipettes | Fisher Scientific | 13-678 | |
curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 03-377-23 | Only barrel of syringe will be needed |
sterlized spoon | Home supply store | ||
Cotton ball(s) | Home supply store | ||
Polyester sewing thread | Home supply store | ||
Masking tape | Home supply store | ||
thumb tacks | Home supply store | ||
styrofoam pad | 50 mL conical rack | ||
cookie/baking sheet | Home supply store | ||
Absorbant underpads | Fisher Scientific | 14-206-64 | |
19 L water bath | Fisher Scientific | TSCOL19 | |
BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage | Becton Dickinson | 381412 | Plastic cathetar with retractable needle |
Crystallizing dishes 100×50 | VWR | 89000-290 | |
Polystyrene petri dishes | Sigma Aldrich | P5481-500EA | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
graduated pipettes (5 mL) | Fisher Scientific | 170355 | |
graduated pipettes (25 mL) | Fisher Scientific | 170357 | |
EasyStrainer 100 μM | Greiner bio-one | 542000 | 100 μm filter |
EasyStrainer 40 μM | Greiner bio-one | 542040 | 40μm filter |
Sterile transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
Refrigerated swinging bucket centrifuge | Sorvall Legend XTR | 75-217-406 | Centrifuge with swinging bucket rotar |
Galaxy 170R tissue culture incubator | Eppendorf | CO170R-120-0000 | Humidified tissue culture incubator |
Reagents | |||
Name | Compound | Grams (g/L) | Millimolar (mM) |
Buffer 1, pH 7.4 | NaCl | 8.3 | 142 |
KCl | 0.5 | 6.7 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Buffer 2, pH 7.4 | NaCl | 3.9 | 66.74 |
KCl | 0.5 | 6.71 | |
CaCl2 | 0.7 | 6.31 | |
HEPES | 24 | 100 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
Phenol Red | 0.01 | 0.03 | |
Buffer 3, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.35 | 4.7 | |
MgSO4 | 0.08 | 0.66 | |
CaCl2 | 0.18 | 1.62 | |
HEPES | 2.4 | 10 | |
BSA | 15 | 0.226 | |
PBS, pH 7.4 | NaCl | 8 | 137 |
KCl | 0.2 | 2.7 | |
Na2HPO4-7H2O | 1.15 | 4.3 | |
KH2PO4 | 0.2 | 1.4 | |
Other reagents | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Percoll (PVP solution) | GE Healthcare | 288555 | |
Collagenase Type IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
Isoflurane | Abcam | ab144581 | |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | Gibco | 11965118 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Long-term Hepatocyte Growth Medium | |||
DMEM | |||
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 | |
Glucagon | Sigma | G3157-2mg | 14 ng/mL |
Insulin | Sigma | I9278-5mL | 0.5 U/mL |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1g | 7.5 mg/mL |
Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354001-100ug | 20 ng/mL |
LSEC medium | |||
RPMI | Gibco | 11875119 | |
10% by volume fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Pen/Strep (2x) | Gibco | 15140148 |