我们描述了通过荧光活性细胞分类,使用人类白细胞抗原-1(HLA-1)作为阴性标记,从人类肉瘤患者衍生的异种移植物分离肿瘤启动细胞的详细方案,以及进一步的验证和这些HLA-1阴性肿瘤启动细胞的表征。
在过去十年中,越来越多的证据支持了肿瘤启动细胞(TICs)的存在和重要性。这些TICs已被证明负责肿瘤的启动,转移和耐药性。因此,除了当前的化疗策略外,开发特定的 TIC 靶向治疗非常重要,这些策略主要侧重于大部分非 TIC。为了进一步理解TCS恶性肿瘤背后的机制,我们描述了一种在人肉瘤中分离和表征TCS的方法。本文中,我们展示了一个详细的方案,用于生成人类肉瘤的患者衍生异种移植物(PDX),并使用人类白细胞抗原I(HLA-1)作为阴性标记物,通过荧光活性细胞分类(FACS)分离TFC。此外,我们描述了如何对这些TTC进行功能特征表征,包括球形测定和肿瘤形成测定,并诱导沿分因途径分化。PDX TTC 的分离和表征为发现潜在的靶向治疗试剂提供了线索。此外,越来越多的证据表明,该协议可进一步扩展,以分离和表征TCS从其他类型的人类癌症。
在过去十年中,越来越多的证据支持了人类癌症的肿瘤细胞内异质性。与正常组织类似,癌症组织由小亚群的TCS(也称为癌症干细胞)组成,具有肿瘤形成能力;同时,大部分癌细胞表现出分化的表型2。这些TTC表现出干细胞状的特性,包括干细胞标记的表达和自我更新和不对称细胞分裂的能力,因此,可以启动细胞异质肿瘤3的形成。最近的研究表明,TCS不仅负责肿瘤的启动,而且还与肿瘤侵略性4,转移5和耐药性6相关。因此,了解 TTC 的生物学非常重要,因此,制定针对这些 TIC 的特定治疗策略。
基于FACS的方法已经用于识别使用TCS标记的TCS,包括CD133、CD24和CD441。这些标记大部分也表达在正常干细胞7。但是,这些标记没有单独标记 TFC。这些分子在TCS恶性作用尚不清楚。例如,CD133可以经常通过DNA甲基化灭活,因此,这种肿瘤间异质性可能使这些标记8的准确性。ALDH1是一个标记,也功能,以保持TICs9的茎。它似乎更有效地识别乳腺癌TCS,但在其他肿瘤类型9中仍然值得怀疑。一些信号通路在干细胞生物学中起着重要的作用,包括Wnt(无翼相关整合位点)、TGF-+(转化生长因子β)和Hedgehog1。但很难证明这些途径是特定于TIC的,并且使用这些途径的活性从原发性肿瘤中分离TCS。因此,迫切需要一种可靠的新型TIC标记。
人类MHCI类,也称为HLA-1,是一种细胞表面蛋白,在几乎所有核细胞中表达10。HLA-1的作用是抗原,呈现CD8 T细胞10特别识别的分子。当癌细胞通过HLA-1产生肿瘤抗原时,CD8 T细胞的细胞毒性作用可以激活。因此,癌细胞细胞表面缺乏HLA-1可导致细胞毒性CD8 T细胞的免疫逃逸。HLA-1的降量在不同类型的人类癌症中已有所描述,并且与预后差、转移和耐药性11相关。我们已经表明,在细胞表面的HLA-1表达的丢失可用于识别肉瘤中的TCS,以及前列腺癌6,12。
在这里,我们描述了一个详细的协议,用HLA-1作为负标记,将TCS与人肉瘤PDX分离,并进一步验证和描述这些HLA-1阴性TTC。
有几个关键步骤限制了该协议的成功,从人类肉瘤PDX分离和表征肿瘤启动细胞。 人类肉瘤包括许多不同的亚型。我们观察到PDX的形成高度依赖于肉瘤亚型。临床侵略性肉瘤与组织学未分化表型(例如,胸腔未分化肉瘤[成功率100%,n = 2],去分化脂肉瘤[成功率100%,n = 2]和丝状肉瘤 | 成功率 100%,n = 3°) 具有高 PDX 形成的成功率。 同时,具有分化表型(例如,分化良好的脂质瘤[成功率 0%,n = 3])的肉瘤显示较低的PDX 形成率。与恶性程度较低的分化亚型相比,肿瘤启动细胞可能以更高的百分比存在于更多的恶性亚型中。此外,我们建议在一天内完成肿瘤启动细胞分离程序,无需停止任何停止,以尽量减少任何细胞活力损失。
我们已经发现HLA-1阴性细胞广泛存在于人类肉瘤中。但是HLA-1阴性细胞的百分比在不同的患者样本中可能有所不同。通过这种方法,我们成功地从HLA-1阴性细胞的样本中分离出肿瘤启动细胞,范围从小于0.5%到超过30%12。通过球形形成和肿瘤形成测定来表征HLA-1阴性细胞,以确认分离的HLA-1阴性细胞的肿瘤启动细胞特性非常重要。
但是,此处介绍的协议也有局限性。以往的数据表明,HLA-1表达是表观调控的,这与HLA-1表达在同一肿瘤12内的细胞异质性的观察是一致的。在肉瘤和其他癌症类型中检测到HLA-1基因组突变。HLA-1基因突变可能导致整个肿瘤细胞表面的HLA-1完全丧失,或表达非功能性突变的HLA-1。在这两种情况下,HLA-1 的负性不能用于识别肿瘤内的 TCS。
利用HLA-1作为负标记,我们成功地从各种人类肉瘤亚型中分离出TIC,并通过功能分析验证了结果。因此,我们能够进行分子研究,包括对TICs的基因表达分析,以开发针对这些TICs的特定治疗。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了NCI-P01-CA087497(C.C.-C.C.)的支持。 和 D.H.)和 NIH-U 54-0OD020353(到 C.C.、D.H.和 J.D.-D.),安捷伦思想领袖奖(授予 C.C.-C.)和马特尔基金会(授予 C.C.-C.和 J.D.-D.)。
0.2 μm cell culture filter | ThermoFisher | 450-0020 | |
100 mm Petri dish | Falcon | 353003 | |
15 mL conical tube | Falcon | 352196 | |
35 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 mL polystyrene tube | Falcon | 352070 | |
96-well ultra-low attachment cell culture plate | Corning | 7007 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
B-27 | Gibco | 08-0085SA | |
bFGF | Invitrogen | PHG0021 | |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
HLA-1-PE antibody | Abcam | ab43545 | |
hMSC growth medium | ATCC | PCS-500-030 | |
indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
isobutylmethylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
Isotype Control Antibody | Abcam | ab103534 | |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
MEM Alpha | Gibco | 12571-063 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
NSG mice | The Jackson Lab | 005557 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
PBS | Corning | 21-040-CM | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Syringe with needle | BD | 309626 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |