Vi beskriver ett detaljerat protokoll för isolering av tumör-initierande celler från humana sarkom-patientbaserade xenografter genom fluorescensaktiverad cell sortering, med humant leukocytantigen-1 (HLA-1) som en negativ markör, och för ytterligare validering och karakteriseringen av dessa HLA-1-negativa tumör-initierande celler.
Förekomsten och betydelsen av tumör-initierande celler (TICs) har fått stöd av ökande bevis under det senaste decenniet. Dessa TICs har visat sig vara ansvarig för tumör initiering, metastaser, och läkemedelsresistens. Därför är det viktigt att utveckla specifika TIC-targeting terapi utöver nuvarande kemoterapi strategier, som främst fokuserar på merparten av icke-TICs. För att ytterligare förstå mekanismen bakom malignitet av TICs, beskriver vi en metod för att isolera och karakterisera TICs i mänskliga sarcomas. Häri visar vi ett detaljerat protokoll för att generera patient-härledda xenograft (pdxs) av mänskliga sarkom och att isolera TICs genom fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) med hjälp av humant leukocytantigen klass I (HLA-1) som en negativ markör. Dessutom beskriver vi hur man funktionellt karakterisera dessa TICs, inklusive en sfär formation analys och en tumör formation assay, och att framkalla differentiering längs mesenkymala vägar. Isoleringen och karaktäriseringen av PDX TICs ger ledtrådar för upptäckten av potentiella mål terapi reagenser. Dessutom tyder ökande bevis på att detta protokoll kan utvidgas ytterligare för att isolera och karakterisera TICs från andra typer av mänskliga cancerformer.
Intratumoral cellulära heterogenitet av mänskliga cancerformer har fått stöd av ökande bevis under det senaste decenniet1. Liknar normal vävnad, cancervävnad består av en liten subpopulation av TICs (även kallad cancer stamceller), som uppvisar tumörbildande förmåga; samtidigt, huvuddelen av cancerceller uppvisar differentierade fenotyper2. Dessa TICs visar stamcells-liknande egenskaper, inklusive uttrycket av en stamcells markör och förmågan hos både självförnyelse och asymmetrisk celldelning, och därmed kan initiera bildandet av en cellulär heterogena tumör3. Nyligen genomförda studier har visat att TICs är inte bara ansvarig för tumör initiering men är också förknippade med tumör aggressivitet4, metastaser5, och läkemedelsresistens6. Därför är det viktigt att förstå TICs biologi och därmed utveckla en specifik behandlingsstrategi som riktar sig till dessa TICs.
FACS-baserade metoder har använts för att identifiera TICs med hjälp av TICs markörer, inklusive CD133, CD24 och CD441. De flesta av dessa markörer uttrycks också i normala stamceller7. Ingen av dessa markörer markerar dock enbart TICs. Rollerna dessa molekyler spelar i malignitet av TICs är fortfarande oklart. Till exempel kan CD133 ofta inaktiveras genom DNA-metylering, och därmed kan denna intertumoral heterogenitet göra riktigheten av dessa markörer8. ALDH1 är en markör som också fungerar för att bibehålla stemness av TICs9. Det verkar vara mer effektivt för att identifiera bröstcancer TICs men är fortfarande tveksamt i andra tumörtyper9. Vissa signalvägar spelar viktiga roller i stamcellsbiologi, inklusive WNT (Wingless-relaterade integration site), TGF-β (omvandla tillväxtfaktor beta), och Hedgehog1. Men det är svårt att bevisa att dessa vägar är TIC-specifika och att använda aktiviteten av dessa vägar för att isolera TICs från primära tumörer. Därför är en tillförlitlig roman TIC markör akut behövs.
Human MHC klass I, även kallad HLA-1, är ett cellytprotein som uttrycks i nästan alla kärn celler10. HLA-1 fungerar som ett antigen som presenterar en molekyl som är specifikt erkänd av CD8 T-celler10. Den cytotoxiska effekten av CD8 T-celler kan aktiveras när cancerceller presentera en tumörantigen av HLA-1. Därför, saknar HLA-1 på cellytan av cancerceller kan leda till en immun flykt från cytotoxiska CD8 T celler. Nedregleringen av HLA-1 har beskrivits i olika typer av Human cancer och är korrelerad med dålig prognos, metastaser och läkemedelsresistens11. Vi har visat att förlusten av HLA-1-uttrycket på cellytan kan användas för att identifiera TICs i sarcomas, samt i prostatacancer6,12.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera TICs från mänskliga sarkom PDXs av FACS, med hjälp av HLA-1 som en negativ markör, och för att ytterligare validera och karakterisera dessa HLA-1-negativa TICs.
Det finns flera kritiska steg som begränsar framgången för detta protokoll för att isolera och karakterisera tumör-initiera celler från mänskliga sarkom PDXs. Human sarkom innehåller många olika subtyper. Vi observerade att PDX formation är mycket beroende av sarkom subtyper. Kliniska aggressiva sarkom med en histologiskt odifferentierad fenotyp (t. ex., pleomorfa odifferentierade sarkom [framgång Rate 100%, n = 2], dedifferentierad liposarcomas [framgång Rate 100%, n = 2], och LED sarkom [ andelen framgångsrika 100%, n = 3]) har en hög framgång i PDX-bildningen. Under tiden, sarkom med differentierade fenotyper (t. ex., väl differentierade liposarcomas [framgång 0%, n = 3]) visar lägre PDX formation priser. Det är möjligt att tumör-initierande celler är närvarande i mer maligna subtyper på en högre andel än i mindre maligna, differentierade subtyper. Dessutom rekommenderar vi att du avslutar tumörinitierande cell isolerings proceduren inom en dag utan något stopp för att minimera förlust av cellernas lönsamhet.
Vi har identifierat att HLA-1-negativa celler finns mycket i mänskliga sarkom. Men andelen HLA-1-negativa celler kan variera mellan olika patienter. Med den här metoden har vi framgångsrikt isolerat tumör-initierande celler från prover som har HLA-1-negativa celler som sträcker sig från mindre än 0,5% till mer än 30%12. Det är viktigt att karakterisera HLA-1-negativa celler funktionellt genom sfär bildning och tumör formation analyser för att bekräfta tumörinitierande cell identiteten hos isolerade HLA-1-negativa celler.
Det protokoll som presenteras här har dock också begränsningar. Tidigare data visade att HLA-1-uttrycket är epigenetiskt reglerat, vilket är förenligt med observationen av HLA-1-uttryckets cellulära heterogenitet inom samma tumör12. HLA-1-genomiska mutationer upptäcktes i sarkom och andra cancertyper. Mutationer i HLA-1-gener kan leda till fullständig förlust av HLA-1 på cellens yta i hela tumören eller till att uttrycka icke-funktionella muterade HLA-1. I båda fallen, HLA-1 negativitet kan inte användas för att identifiera TICs inom tumören.
Med hjälp av HLA-1 som en negativ markör har vi framgångsrikt isolerat TICs från en mängd olika typer av mänskliga sarkom och validerat våra resultat genom funktionell analys. Således kunde vi utföra molekylära studier inklusive gen uttrycks analys på TICs, för att utveckla specifik behandling riktad mot dessa TICs.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av NCI-P01-CA087497 (till C.C.-C. och D.H.) och NIH-U 54-0OD020353 (till C.C.-C., D.H., och J.D.-D.), den Agilent tänkte Leader Award (till C.C.-C.), och Martel Foundation (till C.C.-C. och J.D.-D.).
0.2 μm cell culture filter | ThermoFisher | 450-0020 | |
100 mm Petri dish | Falcon | 353003 | |
15 mL conical tube | Falcon | 352196 | |
35 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 mL polystyrene tube | Falcon | 352070 | |
96-well ultra-low attachment cell culture plate | Corning | 7007 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
B-27 | Gibco | 08-0085SA | |
bFGF | Invitrogen | PHG0021 | |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
HLA-1-PE antibody | Abcam | ab43545 | |
hMSC growth medium | ATCC | PCS-500-030 | |
indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
isobutylmethylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
Isotype Control Antibody | Abcam | ab103534 | |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
MEM Alpha | Gibco | 12571-063 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
NSG mice | The Jackson Lab | 005557 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
PBS | Corning | 21-040-CM | |
penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Syringe with needle | BD | 309626 | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |