Инфекция тканях человека с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) ex vivo обеспечивает ценный 3D модель патогенеза вирусов. Здесь мы описываем протокол для обработки и заразить пробах тканей человека миндалин и женских половых mucosae с ВИЧ-1 и поддерживать их в культуре в интерфейсе жидкости воздух.
Histocultures позволяют изучать межклеточных взаимодействий в тканях человека, и они могут быть использованы для модели взаимодействия хост возбудитель контролируемых лабораторных условиях. Ex vivo инфекции человека тканей с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), среди других вирусов, успешно используется для расследования ранних патогенеза заболеваний, а также платформу для тестирования эффективности и токсичности противовирусных препаратов. В настоящем протоколе мы объясним, как обрабатывать и заразить эксплантов ткани ВИЧ-1 от человека миндалин и шейки матки mucosae и поддерживать их в культуре на вершине желатин губки на интерфейсе жидкости воздуха около двух недель. Этот параметр-поляризованных культуры увеличивает доступ к питательных веществ в питательной среды и кислорода, хотя прогрессирующая потеря целостности тканей и функциональной архитектуры остается основным ограничением. Этот метод позволяет мониторинга репликации ВИЧ-1 и патогенез, используя несколько методов, в том числе immunoassays, ПЦР и проточной цитометрии. Значение физиологическое изменчивость между донорами ткани, а также между эксплантов из разных областей же образца, может существенно повлиять на результаты экспериментов. Для обеспечения воспроизводимости результатов, важно использовать достаточное количество эксплантов, технические реплицирует и доноров соответствием контроля условий для нормализации результаты экспериментального лечения при компиляции данных из нескольких экспериментов (т.е. ., проведенные с помощью ткани от различных доноров) для статистического анализа.
Монотипические Би мерного клеточных культур, здесь упоминаемые как обычных, не учитывают пространственная и функциональная связь между большим разнообразием типов клеток, которые составляют ткани и органы. Этот аспект имеет первостепенное значение для экспериментальных моделях болезней, как вмешательство в гомеостатических межклеточных взаимодействий является движущим фактором всех патологий. Ткани эксплантов предлагают преимущества для моделирования здоровья и болезни среди людей, поскольку они сохраняют cytoarchitecture и многие важные аспекты функциональных органов, как они находятся в естественных условиях, хотя за ограниченное количество времени1. Например после ex vivo вызов с антигенами напомнить, например, дифтерии анатоксином или столбняка, миндалин ткани реагирует с энергичной производства антиген специфические антитела2. Как и любой другой ex vivo модели, histoculture имеет свои собственные ограничения: изменчивость между донорами, ткань поляризации, выживание ограничены ткани и сложности в мониторинге клетки за пределы глубины confocal микроскопии1. Тем не менее эксплантов тканей человека остаются модель выбора для изучения гомеостаза и патогенных иммунологические процессы в организме человека, в том числе хост возбудитель взаимодействий и потенциальных терапевтических вмешательств3.
Критические события патогенеза ВИЧ-1, имели место в тканях. Инфицирования слизистой оболочки половых органов приходится большинство всех ВИЧ-1 передачи события во всем мире4. Лимфоидной ткани является основной сайт репликации вируса во время острой инфекции и гаваней значительный пул латентно инфицированных клеток5, и их сохранение представляет собой основное препятствие для достижения лечения6. Культура и ex vivo вызов человека лимфоидных и слизистых тканей обеспечивают ряд преимуществ перед обычными системами на основе изолированных клеток для изучения ВИЧ-1. Например клетки ткани резидент может поддерживать инфекции ВИЧ-1 в отсутствие внешних активации, в отличие от мононуклеаров периферической крови1. Использование эксплантов лимфоидной ткани позволило лучше понять некоторые ключевые механизмы, лежащие в основе CD4 T клеток истощениет.е., прохожий эффект7, который является отличительной чертой острой инфекции. Сохранение структуры как B клеток фолликулов в лимфоидной ткани8 и эпителия в женских половых слизистой эксплантов9 предлагает уникальную возможность интегрировать пространственные и функциональные особенности ВИЧ-1 инфекции на этих сайтах. Наконец histocultures были успешно использованы модели и исследования герпеса и ВИЧ-1 инфекции10,11, а также для Доклинические испытания антиретровирусных препаратов и multitarget бактерицидные12, 13 , 14 , 15.
Здесь мы описываем подробный протокол для культуры тканей человека эксплантов, полученные из миндалин и слизистых тканей от нижней женских половых органов (матки), охватывающих рассечение тканей в explant вызов с ВИЧ-1-поляризованных способом. Культура ткани эксплантов в жидкость воздуха интерфейс, с помощью губки желатин в качестве поддержки, максимизирует воздействие воздуха кислорода, обеспечивая доступ к питательной среды питательные вещества через Губка капилляров, затягивая тем самым их естественного распада. Наиболее непосредственным способом оценки репликации ВИЧ-1 в нашей системе заключается в том, чтобы измерить количество вируса, выпущенное в среде культуры экспланта со временем иммуноанализа или ПЦР. Инфекции ВИЧ-1 и патогенез (например., CD4 T клеток истощения) могут также быть оценены в ткани эксплантов путем массового извлечения РНК/ДНК и ПЦР, в situ пятнать или единого анализа клеток после переваривания ткани проточной цитометрии.
Использование тканей человека эксплантах для изучения инфекции ВИЧ-1 обеспечивает преимущества над традиционными Би мерной и съедобные экспериментальных систем, таких как главные ячейки или клеточных линий, из-за их высокая способность воспроизводить межклеточных взаимодействий и С…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана гранты от Фонда Blanceflor Бонкомпаньи Ludovisi урожденная Бильдт (http://blanceflor.se/), Фонд шведских врачей против СПИДа (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) и Андреа Fondazione e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) к Андреа Introini.
Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
Sterile cell culture grade water | |||
Sterile transportation container | |||
70% ethanol solution | |||
Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
Sterile metal forceps or tweezers | |||
Sterile metal scissors | |||
Sterile flat weighing metal spatula | |||
Sterile scalpels and blades | |||
6-well cell culture plates | |||
12-well cell culture plates | |||
Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
Biological safety cabinet | |||
Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
Water bath set at 37 °C | |||
Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |