إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية باستخدام نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين
Summary
وكثيراً ما يتم تغيير آليات جينية في الدبقي. ويمكن استخدام إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لدراسة النتائج المترتبة على التعديلات الوراثية في الدبقي التي تنتج عن التغييرات في هيستون التعديلات التي تنظم النسخ الكروماتين هيكل والجينات. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين.
Abstract
يمكن إشراك تعديلات جينية في التنمية والتقدم من الدبقي. التغييرات في مثلايشن وأسيتيليشن مروجين والمناطق التنظيمية المسرطنة والمكثفات الورم يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني وتلعب دوراً هاما في الآلية المرضية لاورام الدماغ. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية (رقاقة) هو تقنية شعبية يتيح الكشف عن التعديلات أو غيرها من البروتينات أحكام ملزمة للحمض النووي. على النقيض من رقاقة cross-linked، في رقاقة الأصلي، لا تعامل الخلايا مع فورمالدهايد تساهمي ربط البروتين بالحمض النووي. وهذا مفيد لأنه في بعض الأحيان قد إصلاح crosslinking البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي فقط عابر وليس لها أهمية وظيفية في تنظيم الجينات. وبالإضافة إلى ذلك، يتم رفع الأجسام المضادة عموما ضد الببتيدات غير المثبتة. لذلك، يتم زيادة خصوصية جسم في الشريحة الأصلية. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن رقاقة الأصلي لا ينطبق إلا على دراسة هيستونيس أو غيرها من البروتينات التي تربط محكم للحمض النووي. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ موريني.
Introduction
أحداث جينية متكررة في جليوماس، والمرجح أن تلعب دوراً مهما في نشوء المرض ورم. وفي الواقع، في طب الأطفال الدبقي عالية الجودة، الطفرات في الجينات ترميز المتغيرات هيستون H3.3 و H3.1 تحدث بشكل متكرر1. الطفرات تؤثر التعديلات هيستون وعواقب جينية رئيسية2،3. تحدث الطفرات المتكررة في إيسوسيتراتي نازعة الجينات 1/2 (IDH1/2)، طفرة التي تمنع هيستون تعتمد α-كجم والحمض النووي دي-ميثيلاسايس، والتعديلات الوراثية في المنظمين الكروماتين الأخرى مثل أتركس و DAXX في المراهقين إلى الطيف الكبار، 4. ولذلك، من الأهمية لدراسة كيفية تغيير الطفرات التي تؤثر على المنظمين جينية هيكل الكروماتين والتعديلات التنظيمية هستون، الذي، بدوره، أثرا محسوسا الترنسكربيتوم ورم الخلايا.
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) أداة قوية تستخدم لتقييم أثر إدخال تعديلات جينية في الجينوم5،،من67. في رقاقة الأصلي، الكروماتين يهضم مع نوكلياسي ميكروكوككال (مناسى)، إيمونوبريسيبيتاتيد استخدام جسم مضاد المثارة ضد بروتين الفائدة، وثم هو تنقية الحمض النووي من مجمع الكروماتين إيمونوبريسيبيتاتيد6. خلايا غير ثابتة أثناء الإجراء حتى هذه التقنية قابلة للتطبيق لدراسة البروتينات التي تتفاعل محكم مع الحمض النووي6فقط. نظراً لغياب العابرة للربط الإيدز خصوصية جسم حيث عادة ما يتم رفع الأجسام المضادة ضد الببتيدات أو البروتينات غير المثبتة7. وبالإضافة إلى ذلك، أنه ليس هناك أي خطوة كروسلينكينج، وهذا يقلل من فرص تحديد التفاعلات عابر البروتين-الحمض النووي التي هي غير محددة ولا التنظيمية7،8. يمكن استخدام شرائح التعرف على إثراء التعديلات هستون في منطقة محددة بالجينوم. هنا، نحن بالتفصيل على بروتوكول لأداء رقاقة الأصلي في نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من وراثيا تصميم نماذج الماوس من الدبقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعروضة هنا سوف تمكن المستخدم من أداء رقاقة الأصلي في NS المستمدة من أورام الدماغ المهندسة وراثيا. على النقيض من رقاقة العابرة للربط، يقتصر هذا البروتوكول لدراسة البروتينات التي تربط محكم مع الحمض النووي6. يمكن تعديل عدد الخلايا التي تستخدم عند الضرورة ويمكن الار?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل الوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) منح R37-NS094804، R01-NS074387، R21-NS091555 إلى M.G.C.؛ تمنح المعاهد الوطنية للصحة/NINDS R01-NS076991 و R01 NS082311 R01-NS096756 P.R.L.؛ R01 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-EB022563؛ قسم جراحة الأعصاب؛ ليا في “قلوب سعيدة”، ومؤسسة على الرغم من تشاد إلى M.G.C. و P.R.L. الحمض النووي الريبي الطب الحيوي منحة F046166 إلى M.G.C. F.M.M. معتمد من قبل F31 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-F31NS103500. R.I.Z.-V. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة/منح نيجمس 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
