Native kromatin Immunoprecipitation ved hjælp af Murine hjerne Tumor Neurospheres
Summary
Epigenetiske mekanismer er ofte ændret i gliom. Kromatin immunoprecipitation kunne bruges til at studere konsekvenserne af genetiske ændringer i gliom, der skyldes ændringer i Histon ændringer, som regulerer kromatin struktur og gen transskription. Denne protokol beskriver indfødte kromatin immunoprecipitation på murine hjerne tumor neurospheres.
Abstract
Epigenetiske ændringer kan være involveret i udvikling og progression af gliom. Ændringer i methylering og acetylation af projektledere og regulerende regioner i onkogener og tumor overspændingsbeskyttere kan føre til ændringer i genekspression og spiller en vigtig rolle i patogenesen af hjernetumorer. Native kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en populær teknik, der tillader detektering af ændringer eller andre proteiner stramt bundet til DNA. I modsætning til krydsbundet ChIP i native ChIP, behandles celler ikke med formaldehyd kovalent linke protein til DNA. Dette er en fordel fordi undertiden crosslinking kan lave proteiner, der kun forbigående interagere med DNA og ikke har funktionelle betydning RIBOREGULATION. Derudover er antistoffer generelt rejst mod ikke optagne peptider. Derfor er antistof specificitet øget i native ChIP. Det er dog vigtigt at huske, at indfødte ChIP er kun gældende at studere histoner eller andre proteiner, der bindes stramt til DNA. Denne protokol beskriver indfødte kromatin immunoprecipitation på murine hjerne tumor neurospheres.
Introduction
Epigenetiske begivenheder er hyppige i gliomer og sandsynligvis spille en vigtig rolle i tumor patogenese. Faktisk, i pediatric high-grade gliom, mutationer i gener kodning Histon varianter H3.3 og H3.1 forekommer hyppigt1. Mutationerne påvirker Histon ændringer og har store epigenetiske konsekvenser2,3. I unge til voksne spektrum forekomme tilbagevendende mutationer i isocitrat dehydrogenase gen 1/2 (IDH1/2), en mutation, der hæmmer α-KG afhængig af Histon og DNA de-methylasaes, og genetiske ændringer i andre kromatin lovgivere såsom ATRX og DAXX 4. det er derfor af afgørende betydning at studere hvordan mutationer, der påvirker epigenetiske regulatorer alter kromatin struktur og regulerende Histon ændringer, som til gengæld har en dramatisk effekt på tumorcellerne transkriptom.
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en kraftfulde værktøj, der anvendes til at evaluere virkningen af epigenetiske ændringer i genomet5,6,7. I native ChIP, kromatin er fordøjet med micrococcal nukleasen (MNase), immunoprecipitated ved hjælp af en antistof rejst mod protein af interesse, og derefter DNA er renset fra immunoprecipitated kromatin komplekse6. Celler er ikke faste under proceduren, så denne teknik er kun gældende for studiet af proteiner, der arbejder tæt sammen med DNA6. Fravær af cross-linking aids antistof specificitet, da antistoffer er normalt rejst mod ikke optagne peptider eller proteiner7. Hertil kommer, da der ikke er nogen tværbindingsmidler skridt, mindsker dette chancerne for fastsættelse af forbigående protein-DNA interaktioner, der er ikke specifikke og ikke lovgivningsmæssige7,8. ChIP kan bruges til at identificere berigelsen af Histon ændringer i en specifik genomisk region. Vi detalje her, en protokol for udfører native ChIP i neurospheres (NS) genereret fra genetisk manipuleret musemodeller af gliom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her vil aktivere brugeren kan udføre indfødte ChIP på NS afledt af genetisk manipuleret hjernetumorer. I modsætning til cross-linking ChIP, er denne protokol begrænset til studiet af proteiner, der forbinder stramt med DNA6. Antallet af celler, der anvendes kan ændres efter behov og protokollen kan skaleres. Vi brugt 1 X 106 celler pr. IP, native ChIP kan dog også udføres med så lidt som 4 x 104 celler5. I denne protok…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed/National Institute af neurologiske & streg (NIH/NINDS) tilskud R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 til M.G.C.; NIH/NINDS tilskud R01-NS076991 R01-NS082311 og R01-NS096756 til P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; Afdeling Neurokirurgi; Leah’s Happy Hearts, og Tchad om fundament til M.G.C. og P.R.L. RNA biomedicin Grant F046166 at M.G.C. F.M.M. er støttet af en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. understøttes af NIH / NIGMS give 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
