देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation प्रयोग Murine ब्रेन ट्यूमर Neurospheres
Summary
Epigenetic तंत्र अक्सर तंत्रिकाबंधार्बुद में बदल रहे हैं । क्रोमेटिन immunoprecipitation तंत्रिकाबंधार्बुद में आनुवंशिक परिवर्तन के परिणाम है कि citrullinated संशोधनों जो क्रोमेटिन संरचना और जीन प्रतिलेखन को विनियमित में परिवर्तन से परिणाम का अध्ययन किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल murine ब्रेन ट्यूमर neurospheres पर नेटिव क्रोमेटिन immunoprecipitation का वर्णन करता है ।
Abstract
Epigenetic संशोधन तंत्रिकाबंधार्बुद के विकास और प्रगति में शामिल हो सकते हैं । oncogenes और ट्यूमर दमन के प्रवर्तकों और विनियामक क्षेत्रों के मिथाइल और acetylation में परिवर्तन जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और ब्रेन ट्यूमर के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । देशी क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक लोकप्रिय तकनीक है कि संशोधनों या अंय प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति देता है कसकर डीएनए के लिए बाध्य । पार से जुड़े चिप के विपरीत, देशी चिप में, कोशिकाओं को डीएनए के लिए covalently लिंक प्रोटीन formaldehyde के साथ इलाज नहीं कर रहे हैं । यह लाभप्रद है क्योंकि कभी crosslinking प्रोटीन है कि केवल क्षणिक डीएनए के साथ बातचीत और जीन विनियमन में कार्यात्मक महत्व नहीं है ठीक हो सकता है । इसके अलावा, एंटीबॉडी आम तौर पर फिक्स्ड पेप्टाइड्स के खिलाफ उठाया जाता है । इसलिए, एंटीबॉडी विशिष्टता देशी चिप में वृद्धि हुई है । हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि देशी चिप केवल histones या अंय प्रोटीन है कि डीएनए को कसकर बांध अध्ययन करने के लिए लागू है । यह प्रोटोकॉल murine ब्रेन ट्यूमर neurospheres पर नेटिव क्रोमेटिन immunoprecipitation का वर्णन करता है ।
Introduction
Epigenetic घटनाओं ग्लियोमास में लगातार कर रहे है और संभावना ट्यूमर रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । दरअसल, बाल चिकित्सा उच्च ग्रेड तंत्रिकाबंधार्बुद में, जीन में उत्परिवर्तनों citrullinated वेरिएंट एच 3.3 और एच 3.1 एन्कोडिंग अक्सर1होते हैं । उत्परिवर्तनों citrullinated संशोधनों को प्रभावित और प्रमुख epigenetic है पछले2,3. वयस्क स्पेक्ट्रम के लिए किशोर में, isocitrate डिहाइड्रोजनेज जीन 1/2 में आवर्तक उत्परिवर्तनों (IDH1/2), एक उत्परिवर्तन है कि α-किलो पर निर्भर citrullinated और डीएनए de-methylasaes रोकता है, और ऐसे क्रोमेटिन और ATRX के रूप में अंय DAXX नियामकों में आनुवंशिक परिवर्तन हो सकता है 4. इसलिए, यह महत्वपूर्ण महत्व का अध्ययन करने के लिए कैसे उत्परिवर्तनों कि प्रभावित epigenetic नियामकों क्रोमेटिन संरचना और विनियामक citrullinated संशोधनों, जो बारी में बदल, ट्यूमर ‘ कोशिकाओं transcriptome के एक नाटकीय प्रभाव है ।
क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक शक्तिशाली जीनोम5,6,7में epigenetic संशोधनों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता उपकरण है । देशी चिप में, क्रोमेटिन micrococcal nuclease (MNase), immunoprecipitated एक एंटीबॉडी ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ उठाया का उपयोग कर के साथ पचा रहा है, और फिर डीएनए immunoprecipitated क्रोमेटिन परिसर से शुद्ध है6। कोशिकाओं प्रक्रिया के दौरान तय नहीं कर रहे है तो यह तकनीक केवल प्रोटीन है कि डीएनए के साथ कसकर बातचीत6के अध्ययन के लिए लागू है । पार से जोड़ने एड्स एंटीबॉडी विशिष्टता के अभाव के बाद से एंटीबॉडी आम तौर पर फिक्स्ड पेप्टाइड या प्रोटीन के खिलाफ7उठाया जाता है । इसके अलावा, के बाद से वहां कोई पार से जोड़ने कदम है, यह क्षणिक प्रोटीन-डीएनए बातचीत है कि गैर विशिष्ट है और नहीं विनियामक7,8फिक्सिंग की संभावना कम कर देता है । चिप एक विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र में citrullinated संशोधनों के संवर्धन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां, हम विस्तार neurospheres में देशी चिप (एन एस) तंत्रिकाबंधार्बुद के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से उत्पंन प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ब्रेन ट्यूमर से व्युत्पन्न एनएस पर देशी चिप प्रदर्शन करने के लिए सक्षम हो जाएगा । पार से जोड़ने के लिए चिप के विपरीत, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था/राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के संस्थान (NIH/NINDS) पलाश R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 को M.G.C.; NIH/NINDS पलाश R01-NS076991, R01-NS082311, और R01-NS096756 को P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; न्यूरोसर्जरी विभाग; लिआ है मुबारक दिल, और चाड हालांकि फाउंडेशन M.G.C. और P.R.L. आरएनए के लिए F046166 M.G.C. F.M.M. को एक F31 NIH/NINDS-F31NS103500 द्वारा समर्थित है । R.I.Z.-व्ही. NIH/NIGMS ग्रांट 5T34GM007821-37 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
