네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여
Summary
후 성적인 기계 장치는 자주 glioma에서 변경 됩니다. Chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 chromatin 구조와 유전자 전사 조절에 따른 결과 glioma의 유전 변경의 결과 연구에 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜 murine 뇌 종양 neurospheres에 네이티브 chromatin immunoprecipitation을 설명합니다.
Abstract
후 성적인 수정 개발 및 glioma의 진행에 관련 될 수 있습니다. 메 틸 화 및 발기인의 acetylation oncogenes 종양 억제기의 규제 지역 변경 유전자 발현에 변화를이 끌 하 고 뇌 종양의 병 인에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 네이티브 chromatin immunoprecipitation (칩) 수정 또는 단단히 DNA에 바인딩된 다른 단백질의 검출을 허용 하는 인기 있는 기술입니다. 기본 칩에서 복사해올된 칩 달리 셀 연결할 covalently 단백질 DNA 포름알데히드와 함께 처리 되지 않습니다. 이것은 유리한 때로는 가교만 뚜렷이 DNA와 상호 작용 하 고 유전자 규칙에서 기능적 중요성을 하지 않은 단백질을 해결할 수 있습니다. 또한, 항 체는 일반적으로 고정 되지 않은 펩 티 드에 대 한 발생 합니다. 따라서, 네이티브 칩에서 항 체 특이성 증가 된다. 그러나, 그것은 네이티브 칩 히스톤 또는 DNA에 단단히 바인딩할 다른 단백질 연구에 적용 됩니다만 다는 것을 명심 하는 것이 중요. 이 프로토콜 murine 뇌 종양 neurospheres에 네이티브 chromatin immunoprecipitation을 설명합니다.
Introduction
Epigenetic 이벤트 gliomas에 자주와 가능성이 종양의 병 인에 중요 한 역할. 실제로, 소아과 고급 glioma 인코딩 히스톤 변형 H3.3 및 H3.1 유전자에 있는 돌연변이 발생 자주1. 변이는 히스톤 수정에 영향을 하 고 주요 epigenetic 결과2,3. 성인 스펙트럼에 사춘기에 isocitrate 효소 유전자 1/2 (IDH1/2), α-KG 종속 히스톤과 DNA 드-methylasaes, 억제 하는 돌연변이에 재발 돌연변이 그리고 다른 chromatin 레 귤 레이 터 ATRX 등 DAXX 유전 변경 발생 4. 따라서, 그것은 중요 한 중요성 chromatin 구조 및 규제 히스톤 수정, 차례로, 종양 세포의 transcriptome의 극적인 영향을 미칠 후 레 귤 레이 터에 영향을 주는 돌연변이 변경 하는 방법을 공부 하.
Chromatin immunoprecipitation (칩) 후 성적인 수정 게놈5,,67에 영향을 평가 하는 데 사용 하는 강력한 도구입니다. 기본 칩에서 chromatin micrococcal nuclease (MNase), 제기, 관심사의 단백질에 대 한 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated로 소화 하 고 DNA immunoprecipitated chromatin 복잡 한6에서 정화는 다음. 세포는 DNA6와 긴밀 하 게 상호 작용 하는 단백질의 연구에 대 한 적용만이 기술에 하지 절차 동안 고정 됩니다. Cross-linking의 부재 에이즈 항 체 특이성 항 체는 일반적으로 고정 되지 않은 펩 티 드 또는 단백질7에 대 한 발생 이후. 또한, 아무 상호 단계 때문에, 담합 일반적인 고 하지 규제7,8과도 단백질 DNA 상호 작용의 기회 줄어듭니다. 칩은 특정 게놈 지역에서 히스톤 수정의 농축을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 프로토콜 glioma의 마우스 모델 설계 유전자에서 생성 된 neurospheres (NS)에서 네이티브 칩을 수행에 대 한 선발.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 NS 유전자 조작된 뇌 종양에서 파생 된에 네이티브 칩을 수행 하기 위해 사용자를 하면 수 있습니다. 칩, cross-linking 달리이 프로토콜은 DNA6밀접 하 게 연관 단백질의 연구에 대 한 제한입니다. 필요에 따라 사용 하는 셀의 수를 수정할 수 있습니다 하 고 프로토콜 확장할 수 있습니다. 그러나 IP 당 1 X 106 셀을 사용 하는 우리,, 네이티브 칩도 수행할…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 보조금 R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 M.G.C.;에 의해 지원 되었다 NIH/NINDS 부여 R01-NS076991, R01-NS082311, 및 R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 신경외과 학과; 레 아의 행복 한 마음, 그리고 차드 비록 재단 M.G.C. 및 P.R.L. RNA 의학 그랜트 F046166 M.G.C. F.M.M.에 의해 한 F31 NIH/NINDS-F31NS103500 지원 됩니다. R.I.Z.-V입니다. NIH에서 지원 / NIGMS 부여 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
