Native Chromatin Immunoprecipitation med Murine hjerne svulst Neurospheres
Summary
Epigenetic mekanismer endres ofte i glioma. Chromatin immunoprecipitation kan brukes til å studere konsekvensene av genetiske endringer i glioma som skyldes endringer i histone modifikasjoner som regulerer chromatin struktur og gene transkripsjon. Denne protokollen beskriver innfødt chromatin immunoprecipitation på murine hjerne svulst neurospheres.
Abstract
Epigenetic endringer kan være involvert i utvikling og progresjon av glioma. Endringer i metylering og acetylation av arrangører og regulatoriske regionene oncogenes og svulst suppressors kan føre til endringer i genuttrykk og spiller en viktig rolle i patogenesen av hjernesvulster. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en populær teknikk som gjør påvisning av endringer eller andre proteiner bundet til DNA. I motsetning til krysskoblet ChIP, innfødt chip, behandles celler ikke med formaldehyd covalently koble protein til DNA. Dette er en fordel fordi noen ganger crosslinking kan fikse proteiner som bare transiently samhandle med DNA og har ikke funksjonell betydning i genreguleringen. I tillegg er antistoffer generelt reist mot unfixed peptider. Derfor er antistoff spesifisitet økt i opprinnelige brikken. Det er imidlertid viktig å huske at innfødt ChIP gjelder bare å studere histones eller andre proteiner som binder tett DNA. Denne protokollen beskriver den opprinnelige chromatin immunoprecipitation på murine hjerne svulst neurospheres.
Introduction
Epigenetic hendelser er hyppig i gliomas og trolig spille en viktig rolle i patogenesen ved svulst. Faktisk i pediatric høyverdig glioma forekommer mutasjoner i gener som koder histone varianter H3.3 og H3.1 hyppig1. Mutasjoner påvirker histone modifikasjoner og har store epigenetic konsekvenser2,3. I unge voksne spektrum oppstår tilbakevendende mutasjoner i isocitrate dehydrogenase gen 1/2 (IDH1/2), en mutasjon som hemmer α-KG avhengige histone og DNA de-methylasaes, og genetiske endringer i andre chromatin regulatorer som ATRX og DAXX 4. derfor det er av avgjørende betydning å studere hvordan mutasjoner som påvirker epigenetic regulatorer endrer chromatin struktur og regulatoriske histone modifikasjoner, som i sin tur ha en dramatisk innvirkning av kreftceller transcriptome.
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er et kraftig verktøy som brukes til å evaluere virkningen av epigenetic endringer i genomet5,6,7. I native ChIP, chromatin er fordøyd med micrococcal nuclease (MNase), immunoprecipitated med et antistoff reist mot protein av interesse, og deretter DNA er renset fra immunoprecipitated chromatin komplekse6. Celler fast ikke under prosedyren så denne teknikken er bare anvendelig for studier av proteiner som samarbeide tett med DNA6. Fravær av cross-linking hjelpemidler antistoff spesifisitet siden antistoffer er vanligvis reist mot unfixed peptider eller proteiner7. I tillegg, siden det er ingen cross-linking trinn, reduserer dette sjansene for fikse forbigående protein-DNA interaksjoner som er uspesifikke og ikke regulatoriske7,8. ChIP kan brukes til å identifisere anriking av histone endringer i et bestemt genomisk område. Her, detalj vi en protokoll for utføre native ChIP i neurospheres (NS) generert fra genetisk konstruert musen modeller av glioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presenteres her vil at brukeren skal kunne utføre native ChIP på NS avledet fra genmodifiserte hjernesvulster. I motsetning til cross-linking ChIP, er denne protokollen begrenset for studiet av proteiner som knytter tett med DNA6. Antall celler brukes kan endres etter behov, og protokollen kan besteget. Vi brukte 1 X 106 celler per IP, men opprinnelig ChIP kan også utføres med så lite som 4 x 104 celler5. I denne protokollen analyserte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse/National Institute av nevrologiske lidelser og slag (NIH/NINDS) tilskudd R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 å M.G.C.; NIH/NINDS gir R01-NS076991, R01-NS082311 og R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; Department of Neurosurgery; Leah Happy Hearts og Chad om grunnlaget for M.G.C. og P.R.L. RNA biomedisin Grant F046166 å M.G.C. F.M.M. støttes av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. støttes av NIH NIGMS støtte 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
