Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino
Summary
Mecanismos epigenéticos são frequentemente alterados no glioma. Imunoprecipitação da cromatina pode ser usada para estudar as consequências de alterações genéticas no glioma que resultam de mudanças nas modificações do histone que regulam a transcrição de gene e a estrutura da cromatina. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.
Abstract
Modificações epigenéticas podem estar envolvidas no desenvolvimento e progressão de glioma. Mudanças na metilação e acetilação de promotores e regiões reguladoras de oncogenes e supressores de tumor podem levar a mudanças na expressão gênica e desempenham um importante papel na patogênese de tumores cerebrais. Imunoprecipitação da cromatina nativa (ChIP) é uma técnica popular que permite a detecção de modificações ou outras proteínas rigidamente vinculadas ao DNA. Em contraste com o reticulado ChIP, no ChIP nativo, as células não são tratadas com formaldeído para ligar covalentemente proteínas para DNA. Isto é vantajoso, porque às vezes reticulação pode fixar as proteínas que apenas transitoriamente interagem com o DNA e não têm significado funcional na regulação gênica. Além disso, os anticorpos geralmente são disparados contra péptidos não fixados. Portanto, a especificidade do anticorpo é aumentada em ChIP nativo. No entanto, é importante manter em mente que o ChIP nativo só é aplicável para estudar as histonas ou outras proteínas que se ligam firmemente ao DNA. Este protocolo descreve a imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.
Introduction
Eventos epigenéticos são frequentes em gliomas e provavelmente desempenham um papel importante na patogênese do tumor. Com efeito, em pediátrica glioma de alto grau, mutações em genes que codificam as variantes de histona H3.3 e H3.1 ocorrem com frequência1. As mutações afetam modificações do histone e tem importantes consequências epigenéticas2,3. No adolescente ao espectro de adulto, mutações recorrentes isocitrato desidrogenase gene 1/2 (IDH1/2), uma mutação que inibe a histona dependente de α-KG e DNA de-methylasaes e alterações genéticas em outros reguladores de cromatina como ATRX e DAXX ocorrem 4. portanto, é de fundamental importância para o estudo de como as mutações que afetam epigenéticos reguladores alteram estrutura da cromatina e modificações do histone regulamentar, que, por sua vez, têm um impacto dramático do transcriptoma as células do tumor.
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma poderosa ferramenta usada para avaliar o impacto das modificações epigenéticas no genoma5,6,7. No ChIP nativo, cromatina é digerida com nuclease micrococcal (MNase), immunoprecipitated usando um anticorpo da proteína de interesse, e então DNA é purificado a partir do complexo de cromatina immunoprecipitated6. As células não são fixas durante o procedimento, para que esta técnica só é aplicável para o estudo de proteínas que interagem fortemente com DNA6. A ausência de cross-linking auxilia a especificidade do anticorpo desde que anticorpos são produzidos geralmente contra unfixed peptídeos ou proteínas7. Além disso, desde que não há nenhuma etapa do cross-linking, isso reduz as chances de interações proteína-ADN transientes que são inespecíficos e não regulamentar7,8de fixação. ChIP pode ser usado para identificar o enriquecimento das modificações do histone em uma região específica do genoma. Aqui, detalhamos um protocolo para executar ChIP nativo em neurospheres (NS) gerados a partir de geneticamente projetado modelos de rato de glioma.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado permitirá que o usuário realizar ChIP nativo no NS derivada de tumores cerebrais geneticamente modificados. Em contraste com o cross-linking do ChIP, este protocolo é limitado para o estudo de proteínas que associam firmemente com DNA6. O número de células utilizado pode ser modificado conforme necessário e o protocolo pode ser ampliado. Nós usamos 1 X 106 células por IP, no entanto, o ChIP nativo também pode ser efectuado com tão pouco quanto 4 x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National institutos de saúde nacional Instituto de doenças neurológicas & Stroke (NINDS/NIH) subvenções R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 para M.G.C.; NINDS/NIH concede R01-NS076991 e NS082311-R01 R01-NS096756 a P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; o departamento de neurocirurgia; Leah está feliz corações e Chad embora Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA biomedicina Grant F046166 para M.G.C. F.M.M. é suportado por um F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. é suportado pelo NIH / NIGMS concessão 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
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