Infödda kromatin Immunoprecipitation använder murina hjärnan tumören Neurospheres
Summary
Epigenetiska mekanismer är ofta förändrade i gliom. Kromatin immunoprecipitation kunde användas för att studera konsekvenserna av genetiska förändringar i gliom som uppstår genom ändringar i Histon ändringar som reglerar kromatin struktur och gen transkription. Det här protokollet beskriver infödda kromatin immunoprecipitation på murina hjärnan tumören neurospheres.
Abstract
Epigenetiska förändringar kan vara inblandade i utvecklingen och utvecklingen av gliom. Förändringar i metylering och acetylering av initiativtagare och regulatoriska regioner av onkogener och tumör dämpning kan leda till förändringar i genuttryck och spelar en viktig roll i patogenesen av hjärntumörer. Infödda kromatin immunoprecipitation (ChIP) är en populär teknik som tillåter att upptäcka ändringar eller andra proteiner som tätt bundna till DNA. I motsats till tvärbunden ChIP, i native ChIP, behandlas celler inte med formaldehyd kovalent länka protein till DNA. Detta är fördelaktigt eftersom ibland crosslinking kan fixa proteiner som endast kortvarigt interagera med DNA och har inte funktionell betydelse i genreglering. Dessutom höjs generellt antikroppar mot ofixerade peptider. Därför ökar antikropp specificitet hos infödda ChIP. Det är dock viktigt att komma ihåg att infödda ChIP är endast tillämplig på studera histoner eller andra proteiner som binder hårt till DNA. Det här protokollet beskriver den infödda kromatin immunoprecipitation på murina hjärnan tumören neurospheres.
Introduction
Epigenetiska händelser är frekventerar i gliom och sannolikt en viktig roll i tumör patogenes. Faktiskt i pediatric höggradigt gliom förekommer mutationer i gener som kodar Histon varianter H3.3 och H3.1 ofta1. Mutationerna påverka Histon ändringar och har stora epigenetiska konsekvenser2,3. Hos ungdomar till vuxen spektrum uppstå återkommande mutationer i isocitrate-dehydrogenas gen 1/2 (IDH1/2), en mutation som hämmar α-KG beroende Histon och DNA de-methylasaes, och genetiska förändringar i andra kromatin tillsynsmyndigheter såsom ATRX och DAXX 4. det är därför av avgörande betydelse att studera hur mutationer som påverkar epigenetiska regulatorer alter kromatinstruktur och reglerande Histon ändringar, som i sin tur har en dramatisk påverkan på tumörcellerna transkriptom.
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är ett kraftfullt verktyg som används för att utvärdera effekterna av epigenetiska förändringar i genomet5,6,7. I native ChIP, kromatin är smälta med micrococcal nuclease (MNase), immunoprecipitated med en antikropp mot proteinet av intresse, och sedan DNA renas från immunoprecipitated kromatin komplexa6. Celler är inte fasta under förfarandet så denna teknik gäller endast för studier av proteiner som samverkar tätt med DNA6. Avsaknad av cross-linking hjälpmedel antikropp specificitet eftersom antikroppar oftast invändningar mot ofixerade peptider eller proteiner7. Dessutom, eftersom det finns ingen tvärbindande steg, minskar detta risken för fastställande övergående protein-DNA samspel som är icke-specifika och inte reglerande7,8. ChIP kan användas för att identifiera anrikningen av Histon ändringar i en viss genomisk region. Här, detalj vi ett protokoll för utför infödda ChIP i neurospheres (NS) genereras från genetiskt modifierade musmodeller av gliom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som presenteras här gör det möjligt för användaren att utföra infödda ChIP på NS härrör från genetiskt modifierade hjärntumörer. I motsats till bryggbindningen ChIP, begränsas detta protokoll för studier av proteiner som förknippar tätt med DNA6. Antalet celler som används kan ändras vid behov och protokollet kan skalas upp. Vi använde 1 X 106 celler per IP, men inhemska ChIP kan också utföras med så lite som 4 x 104 celler<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa och nationella institutet för neurologiska sjukdomar & Stroke (NIH/NINDS) bidrag R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 till M.G.C.; NIH/NINDS beviljar R01-NS076991, R01-NS082311 och R01-NS096756 till P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; Avdelningen för neurokirurgi; Leah’s Happy Hearts och Tchad men grunden till M.G.C. och P.R.L. RNA biomedicin Grant F046166 till M.G.C. F.M.M. stöds av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. R.I.Z.-V. stöds av NIH NIGMS bevilja 5T34GM007821-37.
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
Referências
- Schwartzentruber, J., et al. Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma. Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).
- Bjerke, L., et al. Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN. Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).
- Bender, S., et al. Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas. Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).
- Maleszewska, M., Kaminska, B. Is glioblastoma an epigenetic malignancy?. Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).
- Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645 (2012).
- Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. Native chromatin immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).
- Turner, B. . Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. J Vis Exp. (96), (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Estimation of cell number by hemocytometry counting. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Hwang, W. W., et al. Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia. Elife. 3, e02439 (2014).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
